硝基呋喃類(lèi)藥物（nitrofurans）廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治 療，常見(jiàn)的硝基呋喃藥物包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因，硝呋索爾也是一種硝基呋喃類(lèi)抗 菌藥物，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與呋喃唑酮等其它硝基呋喃類(lèi)藥物相似，原藥在動(dòng)物組織中代謝快速，生成代謝產(chǎn)物 3，5-二硝基水楊酸肼(3，5-Dinitrosalicylic acid hydrazide，DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸，此類(lèi)代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)能與蛋白緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)合態(tài)殘留物，可在體內(nèi)存在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，具有一定的毒性。

根據(jù)歐盟 (EU ) 2019/1871 法規(guī)要求，自2022年11月28日起，動(dòng)物源性食品需符合硝基呋喃代謝物 (增加硝呋索爾代謝物，共5種) 測(cè)定限值 0.5μg/kg的要求。海關(guān)總署也發(fā)函要求輸歐盟養(yǎng)殖水產(chǎn)品、禽肉制品、蜂產(chǎn)品等動(dòng)物源食品要批批檢測(cè)硝基呋喃（含硝呋索爾）。

安譜實(shí)驗(yàn)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝呋索爾代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》征求意見(jiàn)稿，對(duì)方法進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，提供同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中硝呋索爾、硝基呋喃代謝物殘留量的完整應(yīng)用解決方案。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1、標(biāo)準(zhǔn)品

硝呋索爾代謝物3,5-二硝基水楊酸肼(DNSAH)，CDAA-S-300176-XA-1ml，100 mg/L于甲醇/水；

硝呋索爾代謝物內(nèi)標(biāo)3,5-二硝基水楊酸肼-15N2 (DNSAH-15N2)，10 mg/L于甲醇，CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml；

4種硝基呋喃類(lèi)代謝物混標(biāo)，CDAA-M-520005-AB-1ml，100 mg/L于甲醇；

4種硝基呋喃類(lèi)代謝物內(nèi)標(biāo)混標(biāo)，CDAA-M-520006-AA-1ml，100 mg/L于甲醇；

表1-1硝呋索爾、4種硝基呋喃類(lèi)代謝物及內(nèi)標(biāo)基本信息

前處理操作

1、樣品前處理

基質(zhì)樣品：魚(yú)、蝦

水解和衍生化：

取試料2g（精確±0.01g），于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL 4種硝基呋喃類(lèi)代謝物內(nèi)標(biāo)工作液（0.1 μg/mL）和100 μL DNSAH內(nèi)標(biāo)工作液（0.1 μg/mL），渦旋混合1min，加0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL、0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15mL，渦旋混合1min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃避光振蕩16h。

提取和凈化：

用磷酸氫二鉀溶液調(diào) pH 至7.0 -7.5，加乙酸乙酯8mL，渦旋振蕩10min，于4 ℃下10000 r/min 離心10min，取上清液至10mL玻璃離心管，40 ℃氮?dú)獯蹈伞＜?.0mL定溶液（氨水乙腈溶液：移取35μL氨水，用10%乙腈水溶液稀釋并定容至100 mL）溶解殘留物，復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4 ℃下13000r/min離心5min，過(guò)0.22μm PTFE濾器，待測(cè)。

注意事項(xiàng)

1、提取步驟離心條件改為在4℃，10 000 r/min離心10 min；

2、樣品復(fù)溶除脂后若仍較渾濁，可低溫冷凍后再離心過(guò)PTFE濾膜或使用超濾離心管；

3、過(guò)0.22μm PTFE針式濾器時(shí)建議過(guò)濾速度慢一些，只收集中間流出液200μL左右即可，使用內(nèi)襯管上機(jī)進(jìn)樣，殘留1/3左右的溶液在注射器中，這樣可以保證樣品相對(duì)清澈，如果全部過(guò)濾完則可能導(dǎo)致溶液渾濁。

4、硝呋索爾和4種硝基呋喃混標(biāo)同時(shí)加標(biāo)檢測(cè)，Z 終復(fù)溶液為氨水乙腈溶液。

2、樣品加標(biāo)

①加標(biāo)水平 0.5 μg/kg（對(duì)應(yīng)上機(jī)溶液濃度 1 ng/mL）：稱(chēng)取樣品后，分別加入0.1 mL 0.01 μg/mL DNSAH標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ，后續(xù)操作同上；魚(yú)肉基質(zhì)和蝦肉基質(zhì)各2個(gè)平行樣；

②加標(biāo)水平 1.0 μg/kg（對(duì)應(yīng)上機(jī)溶液濃度 2 ng/mL）：稱(chēng)取樣品后，分別加入0.2 mL 0.01 μg/mL DNSAH標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ，后續(xù)操作同上；魚(yú)肉基質(zhì)和蝦肉基質(zhì)各2個(gè)平行樣；

③加標(biāo)水平 5 μg/kg（對(duì)應(yīng)上機(jī)溶液濃度 10 ng/mL）：稱(chēng)取樣品后，分別加入0.1 mL 0.1 μg/mL DNSAH標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅰ和0.1 μg/mL 4種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅰ，后續(xù)操作同上；魚(yú)肉基質(zhì)和蝦肉基質(zhì)各2個(gè)平行樣。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取0.01 μg/mL DNSAH 標(biāo)準(zhǔn)工作液和4種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液各0.05mL、0.1mL、0.2 mL，0.1μg/mL 的 DNSAH 標(biāo)準(zhǔn)工作液和4種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液各0.05mL、0.1mL于50 mL 離心管中，除不加基質(zhì)樣品外，其他操作同樣品，得到濃度為0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、和10ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品。

儀器條件

1、液相色譜

a) Athena C18-WP 液相色譜柱（2.1mm*100mm，3μm，貨號(hào)：LAEQ-211073）；

b)柱溫：30℃

c)流速：0.35mL/min

d)進(jìn)樣量：10 μL；

f)流動(dòng)相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸銨溶液；

表3-1 液相色譜梯度洗脫條件

2、質(zhì)譜條件-硝呋索爾

a）離子源噴霧電壓（IS）：-4500 V；

b）霧化溫度（TEM）：500℃；

c）氣簾氣壓力（CUR）：30 psi；

d）霧化氣壓力（GAS1）：60psi；

e）加熱輔助氣（GAS2）：65psi；

f）碰撞氣流速比（CAD）：8；

g) 其他參數(shù)見(jiàn)表3-2。

表3-2 硝呋索爾及其內(nèi)標(biāo)代謝物特征離子參考質(zhì)譜條件

3、質(zhì)譜條件-硝基呋喃

a）離子源噴霧電壓（IS）：4500 V；

b）霧化溫度（TEM）：550℃；

c）氣簾氣壓力（CUR）：30 psi；

d）霧化氣壓力（GAS1）：60psi；

e）加熱輔助氣（GAS2）：65psi；

f）碰撞氣流速比（CAD）：8；

g）其他參數(shù)參見(jiàn)表3-3。

表3-3 硝基呋喃類(lèi)代謝物特征離子參考質(zhì)譜條件

實(shí)驗(yàn)譜圖

1、硝呋索爾實(shí)驗(yàn)譜圖

圖4-1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

（目標(biāo)物及同位素內(nèi)標(biāo)濃度10ng/mL）

圖4-2 魚(yú)肉基質(zhì)樣品譜圖

圖4-3 魚(yú)肉加標(biāo)樣品譜圖（加標(biāo)水平10ng/mL）

圖4-4 蝦肉基質(zhì)樣品譜圖

圖4-5 蝦肉加標(biāo)樣品譜圖（加標(biāo)水平10ng/mL）

2、硝基呋喃實(shí)驗(yàn)譜圖

圖4-6 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖（目標(biāo)物及同位素內(nèi)標(biāo)濃度10ng/mL）

圖4-7 魚(yú)肉基質(zhì)樣品譜圖

圖4-8 魚(yú)肉基質(zhì)加標(biāo)樣品譜圖（加標(biāo)水平10ng/mL）

圖4-9 蝦肉基質(zhì)樣品譜圖

圖4-10 蝦肉基質(zhì)加標(biāo)樣品譜圖（加標(biāo)水平10ng/mL）

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5-1  硝呋索爾及4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2、加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

表5-2  魚(yú)肉基質(zhì)加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

表5-3  蝦肉基質(zhì)加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

優(yōu)化后的方法，硝呋索爾及4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程R2 > 0.995，線性良好。魚(yú)肉、蝦肉基質(zhì)3個(gè)加標(biāo)水平加標(biāo)回收率在80%-120%之間，加標(biāo)回收率良好。能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

實(shí)驗(yàn)耗材