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原理
試料中殘留的硝基呋喃類蛋白結合態(tài)代謝物在酸性條件下水解,經(jīng)2-硝基苯甲醛衍生化, 用乙酸乙酯液液萃取,高速離心凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定,內(nèi)標法定量。
7.1 水解與衍生化 取試料2 g(精確至±0.01 g),于50 mL聚丙烯離心管中,準確加入混合內(nèi)標標準工作液50 μL,渦旋混合1 min,加鹽酸溶液5 mL、2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL,渦旋混合1 min,37oC 避光振蕩16 h。
關鍵詞:洗滌樣品
要點:
? GB/T 21311-2007之前的標準的樣品在水解之前先用10 mL甲醇水洗滌樣品,新標準在水解前是不洗滌樣品的。
? 這一點需要注意,因為硝基呋喃類藥物的代謝物在動物體內(nèi)多數(shù)是以蛋白結合的形式存在,但有部分是游離態(tài)的,比如說SEM、AOZ。
? 目前沒有明確的實驗結論證明,硝基呋喃類藥物的代謝物只是以蛋白結合狀態(tài)存在,所以洗滌樣品的時候會將游離態(tài)的殘留物洗掉,從而影響結果的準確性。
8.2 提取凈化 取出離心管冷卻至室溫,用磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH值至7.0~7.5,加乙酸乙酯8 mL,渦旋振蕩1 min,6000 r/min離心5 min,取上清液至10 mL玻璃離心管,40 oC氮氣吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物,再將溶液轉移至1.5 mL離心管中,以14000 r/min的轉速離心10 min,取下層清液過0.22 μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
關鍵詞:調(diào)pH值至7.0~7.5 要點: ? 大量研究表明,在 pH 為 7-7.5 的弱堿性條件下,乙酸乙酯對AOZ、AMOZ、AHD、SEM 衍生產(chǎn)物的提取效率Z大(能達到 90%以上)。 ? 因為弱堿環(huán)境可以抑制目標物的電離,使其絕大部分呈分子狀態(tài)存在于衍生溶液中,有利于乙酸乙酯對目標物的提取或HLB 固相萃取柱的吸附,從而增強富集凈化的效果。 ? 但當 pH 值為 8-10 時,乙酸乙酯對 AHD 的萃取效率很低,因此需要將硝基呋喃代謝物酸性衍生溶液的 pH 值調(diào)節(jié)到 7-7.5 范圍。 |
關鍵詞:高速離心,0.22 um濾膜 要點: ? 相之前的標準,新標準增加了高速離心步驟(14000 r/min的轉速離心),以及過0.22 um濾膜。 ? 通過高速離心可以進一步凈化試樣溶液,把一些不溶于5%甲醇溶液的物質(zhì),通過高速離心沉淀下來,有部分的脂肪也可以通過高速離心分離出來。 |
? 另外,新增的0.22 um,為更好去除試樣的雜質(zhì),保護色譜分析系統(tǒng)。 |
關鍵詞:渾濁 要點: ? Z后一步用 5%甲醇水定容后出現(xiàn)渾濁,說明溶質(zhì)過飽和(可能是樣品的脂肪、蛋白等含量過高所致),通常是前處理過程中凈化步驟不徹底導致的。 ? 一般解決方法有兩種:一是定容后置于冰箱(4℃)冷藏 2 小時以上,使脂肪充分析出,取出后高速冷凍離心,取上清液進行檢測; ? 二是參考《GB/T 20752-2006》標準的處理方式——加入 10 mL 甲醇+水混合溶液(2+1)均質(zhì),然后離心棄去上清液再過 Anavo HLB 小柱凈化效果更好。 |
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