生物治療蛋白是一類高度復(fù)雜的分子。該生產(chǎn)過程中將產(chǎn)生許多不同的蛋白異構(gòu)體，因此，確保此類產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要。這意味著需要確認(rèn)產(chǎn)品的正確生產(chǎn)、任何雜質(zhì)均得到鑒定和定量，并且對蛋白的效價進行測定。了解不同類型的雜質(zhì)和各自的風(fēng)險構(gòu)成了關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 監(jiān)測的基礎(chǔ)。

本應(yīng)用文集分別從滴度測定篇、完整蛋白質(zhì)和亞基純度篇、肽譜分析篇、氨基酸分析篇、多聚糖分析篇、聚集體篇和電荷異構(gòu)體分析篇七個章節(jié)分別重 點介紹一些適用于不同方面 CQA 監(jiān)測的 HPLC 應(yīng)用，同時為可能涉及的不同類型檢測中所需用到的液相色譜柱提供使用指導(dǎo)。

滴度測定

在生物治療藥物的生產(chǎn)過程中，滴度測定用于測量發(fā)酵液中目標(biāo)蛋白的濃度。在以下兩種重要的情況下，需要進行準(zhǔn)確的滴度測定。第 一種情況是在克隆篩選過程中，僅選擇那些提供足量目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)染克隆細胞株。第二種情況是在發(fā)酵工藝的放大過程中監(jiān)測目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度：細胞培養(yǎng)基條件的優(yōu)化和Z 佳收獲時間的確定依靠準(zhǔn)確的滴度測定。

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完整蛋白和亞基純度

反相色譜仍然是色譜工作者“武器庫”中Z有價值的工具之一。這是一種廣為人知的技術(shù)，依賴于分析物和固定相之間的疏水相互作用。對于完整蛋白，該技術(shù)使用有機溶劑作為流動相進行梯度洗脫。在這些條件下，分子很可能發(fā)生變性。這是一種靈敏的分析技術(shù)，因為樣品保留在色譜柱上得到濃縮，且適用于質(zhì)譜分析。因此，該技術(shù)適用于測定完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量。

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肽譜分析

肽譜分析是一種強大的技術(shù)，可用于全面鑒定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，還能夠區(qū)分蛋白質(zhì)內(nèi)異構(gòu)體的準(zhǔn)確位點。由于生物治療蛋白的一級結(jié)構(gòu)或氨基酸序列是已知的，因此能夠預(yù)測在使用酶（例如胰蛋白酶）酶解蛋白質(zhì)時將生成的片段。胰蛋白酶通過水解賴氨酸或精氨酸，以及除脯氨酸以外的任何其他氨基酸之間的鍵，將蛋白質(zhì)分解成片段。使用這種方法，曲妥珠單抗將被分解成 62 種單獨的片段，并且高分離度反相分離能夠?qū)⑦@些物質(zhì)分離成經(jīng)典的“指紋”色譜圖。將分離與質(zhì)譜檢測相結(jié)合，能夠?qū)㈦淖V分析色譜圖中觀察到的實際的峰，與分析軟件預(yù)測的預(yù)期片段相關(guān)聯(lián)。

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氨基酸分析

確定蛋白質(zhì)的氨基酸組成是一種成熟的技術(shù)，該技術(shù)通常與其他技術(shù)一起使用以確認(rèn)正確的結(jié)構(gòu)。在分析之前，通常利用酸水解使蛋白質(zhì)水解成氨基酸。氨基酸也是用于制備生物治療蛋白的細胞培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分。通常需要監(jiān)測發(fā)酵反應(yīng)期間各種氨基酸的消耗量，因此可以使用相同的色譜方法。

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多聚糖分析

糖基化是一種重要的翻譯后修飾，因為多聚糖在蛋白質(zhì)識別和生物治療藥物療 效方面起著關(guān)鍵作用。生物治療蛋白的生產(chǎn)需要采用哺乳動物細胞系。糖基化途徑非常復(fù)雜，而且并非所有克隆都能產(chǎn)生所需的糖譜。監(jiān)管機構(gòu)認(rèn)為這是一項重大挑戰(zhàn)，并就如何確定糖指紋圖譜提供了指導(dǎo)，包括使用特定的酶 PNGase F 切割 N-糖，用熒光試劑標(biāo)記它們以提高檢測靈敏度，然后使用親水相互作用色譜 (HILIC) 柱（通常與熒光檢測器結(jié)合使用，但也可使用質(zhì)譜）將它們分離。

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聚集體/片段分析

蛋白質(zhì)經(jīng)常容易由于環(huán)境條件刺激而發(fā)生聚集，形成二聚體和大分子量低聚物或高階結(jié)構(gòu)。這在生物治療蛋白的生產(chǎn)中尤其成問題，因為目標(biāo)蛋白要經(jīng)受可能誘導(dǎo)聚集的多種條件。這些條件包括發(fā)酵過程中溫度和濃度的變化，以及下游處理過程中 pH 和濃度的變化。甚至剪切力（來自葉輪葉片、攪拌器和其他工程設(shè)備）也可能導(dǎo)致與應(yīng)力相關(guān)的聚集。聚集體，特別是分子量非常大的多聚體以至亞可見顆粒的存在，可能會對健康有害。因此，先決條件是量化和確定聚集水平，并予以限制。

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電荷異構(gòu)體分析

由于存在帶正電荷和帶負(fù)電荷的氨基酸以及帶負(fù)電荷的多聚糖（唾液酸），意味著大分子蛋白質(zhì)作為多電荷物質(zhì)存在，并且有幾種副反應(yīng)可導(dǎo)致凈電荷變化。抗體抗原結(jié)合區(qū)內(nèi)的異構(gòu)體對功能的影響可能更為重大。

結(jié)語

Agilent AdvanceBio 色譜柱經(jīng)過精心設(shè)計和制造，能夠在分析高度復(fù)雜的生物治療分子以及監(jiān)測它們的純度、效價和其他關(guān)鍵質(zhì)量屬性時為您提供可靠的結(jié)果。