導(dǎo)言
Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平臺能夠有效地用 HTRF 熒光團標記目標位點上感興趣的蛋白。細胞表面受體可以插入 SNAP-tag 質(zhì)粒中，然后用這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染細胞并表達標記的受體。通過添加 snap -lumi4-Tb 底物，用鋱 (Tb)穴狀化合物標記受體。為了進行結(jié)合試驗，受體的配體用 HTRF 受體熒光團標記，例如 d2。當 d2 配體與鋱標記的受體結(jié)合時，可以使用具備 HTRF 功能的微孔板讀板機檢測受體到配體的時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (TRFRET) ( 圖 1)。

Cisbio 提供了多種標簽和興趣蛋白標記編碼的質(zhì)粒，以及已經(jīng)用這些結(jié)構(gòu)物轉(zhuǎn)染的冷凍細胞。該結(jié)構(gòu)體能夠表達標記蛋白，如受體，可以用鋱標記，同時其受體配體( 激動劑或拮抗劑 ) 用受體熒光團標記。Tag-lite 平臺適用于廣泛的應(yīng)用，如受體二聚化、配體結(jié)合分析和第二信使評估。結(jié)合動力學(xué)可以研究藥物 - 蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合和解離速率，是優(yōu)化候選藥物體內(nèi)療效的必要步驟 1。

優(yōu)勢
? 提供可靠的，免洗的飽和結(jié)合實驗
? Cisbio HTRF 平臺提供多種配置實驗和試劑的選項
? 已有經(jīng)過認證的 HTRF 儀器，確保儀器性能

胰高血糖素樣肽 -1 受體 (GLP1R) 在Pancreatic cells中表達，其激活刺激腺苷酸環(huán)化酶途徑，導(dǎo)致胰島素合成和釋放增加。因此，GLP1R 被認為是治療糖尿病的一個潛在靶點 2。GLP1R 也在大腦中表達，它參與控制食欲，并在記憶和學(xué)習(xí)機制中具有潛在的重要作用。
在這里， 我們展示了如何使用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機使 用 HTRF 進 行可靠的、免洗飽和結(jié)合分析。使用 Tag-lite 技術(shù)在 HTRF認證的 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機上評估 GLP1R 配體的結(jié)合。
飽和結(jié)合實驗
配體結(jié)合實驗是評估特定配體與受體親和力的重要手段，也是理解受體和配體相互作用機制的關(guān)鍵。結(jié)合研究因此成為藥物發(fā)現(xiàn)過程的一部分，有助于設(shè)計出高選擇性和特異性結(jié)合靶標藥物。結(jié)合活性決定了單個生物分子之間的結(jié)合作用，如受體及其配體 ( 如激動劑 )。它通常用飽和分析來檢測，用平衡解離常數(shù) (Kd) 來表示。Kd用于評估配體與其靶標之間的相互作用強度并對其作用強弱程度進行排序。Kd 值越小，配體與靶標的結(jié)合親和力越大。在競爭或抑制研究中，選擇合適的配體濃度是準確測定 IC50 和抑制常數(shù) (Ki) 的必要條件。一般來說，濃度達到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值的配體濃度會使藥物看起來不如它們在體內(nèi)的效力。飽和結(jié)合試驗檢測總結(jié)合和非特異性結(jié)合濃度增加的配體 ( 圖 2 )。熒光配體滴定到含有固定數(shù)量標記細胞的溶液中，孵育至平衡。當熒光配體與受體結(jié)合時，TR-FRET發(fā)生，并通過 HTRF 認證的微孔板讀板機進行檢測。得到的 HTRF 比率代表總結(jié)合。非特異性結(jié)合方式作為陰性對照，其使用未標記的配體進行檢測，說明已標記的配體與受體、非受體分子或微板的非特異性結(jié)合 2。檢測時，將熒光標記的配體滴定到含有固定數(shù)量標記細胞和 100 倍摩爾濃度的未標記配體的溶液中。標記的和未標記的配體競爭與標記的 GPCR 結(jié)合。由于非特異性配體過多，它會與受體結(jié)合，所以不會發(fā)生 TR-FRET。從這種滴定法得到的 HTRF 比率代表非特異性結(jié)合。通過從每個熒光標記配體濃度的總結(jié)合減去非特異性結(jié)合來計算特異性結(jié)合。

材料：
? Tag-lite GLP1R 表達，Tb 標記的冷凍細胞 (Cisbio cat.#C1TT1GLP1)
? Tag-lite 緩沖液 (Cisbio cat. #LABMED)
? GLP1 受體紅色激動劑 (Cisbio cat. #L0030red)
? 毒晰外泌肽 4(Exendin 4，Sigma-Aldrich cat.# 1269105)
? 白色，低體積 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
? 帶有 HTRF 檢測卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011) 的 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #i3x)
? 帶有 HTRF 檢測系統(tǒng) (Molecular Devices cat. #6590-0144, 包含增強型 TRF 模塊及 HTRF 濾光片 )
方法
細胞
根據(jù)產(chǎn)品說明準備細胞，冷凍的細胞在 37℃ 解凍，轉(zhuǎn)移到含有 5 ml 1x Tag-lite 緩沖液 (TLB) 的試管中。4℃，
1200g，離心 5 min。吸出上清液，重懸于 2.7 ml 的 1xTLB 中。
熒光標記配體
GLP1 受體紅色激動劑是一種用紅色熒光 HTRF 探針標記的 Exendin 4 衍生物。將原漿濃度稀釋于 1X TLB 中制備
400 nM 濃度的紅色激動劑 ( 原漿濃度見試劑盒說明書 )。10 個額外的 1:2 稀釋，然后用 1X TLB 得到Z終濃度從
100 nM 到 0.097 nM。
非標記配體
稀釋原溶液到 1 x TLB ( 見產(chǎn)品說明 ) 制 備 40μM 終濃度無標記 Exendin 4 配體。這相當于Z大標記配體濃度
400 nM 的 100 倍摩爾。

實驗板設(shè)置
按照 Cisbio 配體結(jié)合說明書將試劑分配到板內(nèi) ( 圖 3 )。384 孔白板孔內(nèi)注入 10 μL GLP1 受體細胞，5 μL TLB 添加至總結(jié)和孔內(nèi)，5 μL 未標記配體添加至非特異性結(jié)合孔中。Z終，5 μL GLP1 受體激動劑 exendin 4- 紅色標記物添加到所有孔中。將實驗板在室溫孵育 2 h 并用優(yōu)化的儀器設(shè)置 ( 表 1 ) 在 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機上讀取。兩個讀板機都進行高度優(yōu)化以確保Z佳的實驗靈敏度和動態(tài)范圍。

數(shù)據(jù)分析
HTRF 分析涉及 Cisbio 的專利比率法，該方法基于檢測到的兩個發(fā)射波長。616 nm 處的供體發(fā)射光被用作內(nèi)參，而 665 nm 處的受體發(fā)射光被用作測定生物反應(yīng) ( 結(jié)合 ) 的指示劑。這種比率測量 ( 受體與供體熒光的比率 )減少了孔間的變異，并消除了化合物干擾。在下面的步驟4 中計算的 Delta F，將信號去除背景，對于測定之間的比較是有用的。根據(jù) 665 nm / 616 nm 的比值計算結(jié)果，用 Delta F 表示如下 :

數(shù)據(jù)通過 SoftMax Pro 軟件獲取并分析，軟件內(nèi)已預(yù)置了 HTRF 的模板可以簡要的檢測和分析

結(jié)果
對總結(jié)合孔 和非特異性結(jié)合孔的每個標記配體濃度計算 HTRF 比率。通過從每個熒光配體濃度下的總結(jié)合減去非特異性結(jié)合計算特異性結(jié)合。如上文所述，對數(shù)據(jù)進行分析，并 使 用 SoftMax Pro 軟件進行雙直角雙曲線擬合 ( 圖 4 )，得出Z佳結(jié)果，讀數(shù)設(shè)置如表 1 所示。SpectraMax i3x 讀板機產(chǎn)生的飽和曲線 ( 這里沒有顯示 )與 SpectraMax iD5 讀板機類似。在特定飽和曲線中雙直角雙曲線擬合中擬合參數(shù) B 為 Kd。Cisbio 建立了一個 5nM 或更低的 Kd 值，以確認酶標儀能夠成功地測量帶有紅色受體的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 讀板機的 kd值為 0.816 nM, SpectraMax iD5 讀板機的 kd 值為 2.347nM ( 表 2 )，證實了這兩種儀器檢測這些 Tag-lite 實驗的能力。

討論
SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機可分別配備 HTRF 檢測卡盒或增強型 TRF 模塊及濾光片，兩種讀板機都證明了它們能夠
檢測來自鋱供體和紅色受體組合的 HTRF 信號，并且它們可以使用 Tag-lite 技術(shù)進行飽和研究。使用帶有預(yù)先配置的
HTRF 模板的 SoftMax Pro 7.0.3 ( 或更高版本 ) 軟件簡化了數(shù)據(jù)采集和分析。