真核細胞在遭受外界不利條件的脅迫時，細胞穩(wěn)態(tài)往往被擾亂，導致細胞功能的正常運行乃至存活都面臨挑戰(zhàn)。細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白質(zhì)合成、折疊、加工和運輸?shù)闹匾獔鏊獠看碳е碌牡鞍踪|(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡會引起未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ER stress）。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜跨膜蛋白激酶/內(nèi)切核酸酶肌醇需要酶1（IRE1）的激活是未折疊蛋白響應通路（UPR）的一個關鍵信號，激活的肌醇需要酶1（IRE1）可以形成大型聚集物/聚焦簇，但是其確切的結(jié)構(gòu)特點、動態(tài)特征、功能特性迄今為止仍然大部分不明。

為研究細胞抗逆應激的生物學機制，武漢大學生命科學學院劉勇教授課題組于2024年5月8日在國際學術(shù)期刊《Nature Cell Biology》（IF：21.3）上發(fā)表題為“Mammalian IRE1α dynamically and functionally coalesces with stress granules”的文章。 

文章發(fā)現(xiàn)IRE1α能夠在不同應激條件下與應激顆粒（SG）通過相分離形成共聚集簇，提示IRE1α與應激顆粒的協(xié)同共聚能夠富集IRE1α-XBP1通路中的關鍵組分，為IRE1α蛋白機器提供了一個更為高效的運行平臺，從而賦予細胞更強的應激處理能力（下圖1）。

圖1. 哺乳動物細胞中IRE1α-SG共聚集簇的功能機制示意圖

（論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41556-

024-01418-7）

首次揭示未折疊蛋白響應分子IRE1α與應激顆粒共聚集的動態(tài)特征與功能機制，這些發(fā)現(xiàn)為理解細胞如何在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下調(diào)節(jié)IRE1α聚集和應激顆粒形成提供了重要的視角，可能對研究細胞應激反應機制和相關疾病治療具有重要意義。

為了探討不同應激條件下，IRE1α聚集與應激顆粒形成之間的關系，使用化學內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激劑thapsigargin (Tg)（56306ES）處理哺乳動物細胞，來測試內(nèi)源性IRE1α是否能在細胞中形成大的聚集體。使用共聚焦顯微鏡分析和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)在ER應激的HeLa細胞中，IRE1α形成了大量0.5–5 μm的大聚集體/簇或焦點。結(jié)果顯示，含有IRE1α聚集簇的細胞百分比隨著Tg（56306ES）處理劑量的增加和時間的延長而增加，且在Tg處理后3小時達到高峰。這一發(fā)現(xiàn)表明IRE1α聚集簇的形成具有劑量響應性和時間依賴性。（見下圖2）

圖2. IRE1α簇與SG共定位以響應不同類型的應力

通過對應激顆粒骨架蛋白G3BP1進行共染色，發(fā)現(xiàn)應激顆粒的形成也非常強烈，并且與IRE1α聚集體幾乎完全共定位。這表明在ER應激條件下，IRE1α聚集簇和應激顆粒之間存在著密切的空間關聯(lián)。（下圖3）

圖3. 共焦顯微鏡圖像

由于應激顆粒可以由不同的應激條件誘導，探究IRE1α是否也能響應其他應激因子與應激顆粒共聚集。結(jié)果表明，與thapsigargin (Tg)誘導的ER應激相比，使用硫代砷酸鈉（SA）和熱應激（HS）處理能更有效地誘導大型IRE1α聚集簇的形成。這些聚集簇主要與G3BP1陽性的應激顆粒共定位。（下圖4）

圖4. 內(nèi)源性IRE1α在不同類型的應激反應中形成大簇

線性分析IRE1α/G3BP1雙陽性聚集體的結(jié)果也表明了這種共定位現(xiàn)象。同時，在使用TIA1（另一個SG支架標記）共染色時，也在HeLa細胞中檢測到共定位的IRE1α–SG聚集體的形成。（下圖5）

圖5. IRE1α蛋白與SG組分的增強結(jié)合

研究表明，大型IRE1α聚集體的組裝與SG形成有選擇性的關聯(lián)，這是一個普遍的、與細胞類型無關的事件，而不是特定于ER應激的現(xiàn)象。接下來探究生理相關性的應激條件，如缺氧和代謝紊亂對聚集體形成的影響。雖然，在暴露于缺氧條件（1% O2）的HeLa細胞中，沒有觀察到大型IRE1α聚集體或SGs的形成。但是，在葡萄糖剝奪條件下，檢測到了共定位的IRE1α–SG聚集體，特別是在存在糖酵解阻斷劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）（54104ES）的情況下，這種現(xiàn)象尤為強烈，而2-DG并不引起eIF2α的磷酸化。由于2-DG抑制己糖激酶，從而影響己糖生物合成途徑，可能會阻斷ER蛋白的糖基化，這些數(shù)據(jù)表明IRE1α–SG的共聚集也是對營養(yǎng)/代謝應激的響應行為，可能源于ER蛋白折疊的擾動。（下圖6）

圖6. 缺氧和葡萄糖剝奪反應中IRE1α-SG簇形成的分析

接下來，團隊研究了應激HeLa細胞中IRE1α–SG簇的動力學和結(jié)構(gòu)特征。在消除應激源后，可見IRE1α簇與SG協(xié)同減少。表明在應激恢復過程中，IRE1α聚集簇也與SG分解動態(tài)耦合。此外，使用增強型綠色熒光蛋白（EGFP）-Sec61β對ER網(wǎng)絡進行可視化顯示，利用二聚化依賴性熒光蛋白（ddFP）報告系統(tǒng)監(jiān)測來自不同二聚化伴侶的熒光縮合信號，可見IRE1α/G3BP1雙陽性簇圍繞ER小管分布在整個細胞質(zhì)中，IRE1α與核心SG支架蛋白的結(jié)構(gòu)相互作用。（下圖7）

圖7. ER處IRE1α-SG團簇的動力學特征

COS7細胞的共聚焦顯微鏡圖像顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導IRE1α-YFP與G3BP1/TIA1陽性SG的各種合并或并置聚集，其中一些反映了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處縮合物的不對稱分層結(jié)構(gòu)。此外，在Tg和SA應激的細胞中，IRE1α/G3BP1聚集與IRE1α/TIA1聚集基本重疊，表明IRE1α與SG支架蛋白的復雜相互作用。實驗還觀察到聚結(jié)的IRE1α/G3BP1顆粒在Tg誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中在ERin細胞處積極進行分裂和融合。這些結(jié)果表明，IRE1α聚集簇作為其整體伙伴與SG動態(tài)相連。（見下圖8）

圖8. 應力恢復過程中聚結(jié)IRE1α-SG團簇的協(xié)同還原

考慮到SGs的胞質(zhì)位置，我們使用其細胞質(zhì)部分的缺失突變體確定了IRE1α與SGs相關的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。共免疫沉淀分析表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下，IRE1α_ΔL蛋白的胞漿連接區(qū)缺失顯著削弱了其與SG蛋白的結(jié)合，而IRE1α-ΔR或IRE1α/ΔKR蛋白的胞質(zhì)連接區(qū)缺失則顯著削弱了與SG蛋白之間的結(jié)合。研究表明，IRE1α的胞質(zhì)連接子對其與SGs的結(jié)合至關重要。IRE1α的細胞質(zhì)連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)（Linker））具有固有無序區(qū)域（IDR），這是推進其與應激顆粒共聚集的關鍵結(jié)構(gòu)域。

接下來，研究探討IRE1α聚集是否會影響SG的形成，反之亦然。在不同的應力下，IRE1α的損失不影響IRE1α耗盡的HeLa細胞中SG的形成。此外，對G3BP1顆粒與IRE1α缺陷細胞中的ER膜結(jié)合的鈣結(jié)合蛋白（CalN）的相關性的ddFP報告子分析顯示，在ER應激下，SG–ER接觸與對照細胞相當。因此，IRE1α聚集不會嚴重影響SG形成的細胞能力，也不是將SG與ER微管連接的關鍵因素，但SG組裝的破壞會阻止IRE1α聚集簇的形成，并對XBP1 mRNA的剪接加工效率造成影響。

最后研究探討了較高IRE1α RNA酶輸出的分子基礎，即XBP1 mRNA剪接，這是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下形成的大IRE1α-SG簇引起的。實驗通過檢測IRE1α-相鄰蛋白質(zhì)中IRE1α–XBP1軸的關鍵成分的變化，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀況下，IRE1α-SG聚集簇能夠富集IRE1α-XBP1信號途徑中的關鍵成分：RtcB連接酶和XBP1 mRNA底物。相分離形成的IRE1α-SG聚集簇能夠產(chǎn)生更為高效的應激處理工作站——IRE1α內(nèi)切酶加工站，增強細胞的應激能力，高效維護細胞穩(wěn)態(tài)。