摘要

來自武漢大學人民醫(yī)院藥學部湯柳和周本宏研究團隊在《Drug Design, Development and Therapy》（IF：5.1）期刊上發(fā)表了題為“Molecular Mechanisms of Luteolin Against Atopic Dermatitis Based on Network Pharmacology and in vivo Experimental Validation”的研究。該研究通過網(wǎng)絡藥理學、分子對接與體內(nèi)實驗相結合的方式，探究了木犀草素抗特應性皮炎的潛在分子機制，為木犀草素的臨床應用提供了科學依據(jù)。

該研究基于網(wǎng)絡藥理學、分子對接及體內(nèi)實驗驗證，揭示了木犀草素抗特應性皮炎（臨床以復發(fā)性濕疹樣皮損和劇烈瘙癢為特征）的潛在分子機制。研究利用TCMSP、STITCH和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫篩選木犀草素的潛在靶點；從DisGeNET、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫收集特應性皮炎相關靶點；通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.9.0軟件構建交集靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡；進行GO和KEGG富集分析以明確木犀草素抗特應性皮炎的關鍵通路；在2,4-二硝基氟苯誘導的特應性皮炎小鼠模型中，驗證網(wǎng)絡藥理學預測的治療效果、候選靶點及信號通路。體內(nèi)實驗驗證顯示，木犀草素可改善特應性皮炎樣皮膚癥狀，表現(xiàn)為SCORAD評分降低、肥大細胞浸潤減少及皮膚屏障功能恢復；此外，木犀草素通過調節(jié)Th1/Th2/Th17介導的細胞因子產(chǎn)生恢復免疫平衡，且抑制病變皮膚中JAK2和STAT3的磷酸化。本研究通過網(wǎng)絡藥理學與實驗驗證相結合的方式，系統(tǒng)闡明了木犀草素改善特應性皮炎的作用及可能的分子機制，為木犀草素的后續(xù)開發(fā)及臨床應用提供了參考。

研究材料與儀器

材料

2,4-二硝基氟苯、木犀草素、地塞米松、丙酮、橄欖油、乙醇、丙二醇、4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅染色液、甲苯胺藍染色液、BCA蛋白定量試劑盒、Th1/Th2/Th17相關細胞因子ELISA試劑盒、兔抗FLG、抗p-JAK2、抗p-STAT3一抗、山羊抗兔IgG二抗、DAB染色液、DAPI染色液

實驗動物：6周齡雌性KM小鼠

儀器

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、游標卡尺、分析天平、組織包埋機、切片機、光學顯微鏡、酶標儀、離心機、免疫組化染色相關設備、免疫熒光成像設備

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

過程

網(wǎng)絡藥理學分析

1. 靶點篩選：通過TCMSP、STITCH 4.0和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲取木犀草素的潛在靶點，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫注釋并標準化基因符號，去除重復及非人類靶點；以“Dermatitis, Atopic”為關鍵詞，從DisGeNET、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫篩選特應性皮炎相關靶點，去除重復靶點。

2. 交集靶點獲?。豪肰enny 2.1.0在線工具獲取木犀草素與特應性皮炎的交集靶點，即木犀草素抗特應性皮炎的潛在靶點。

3. PPI網(wǎng)絡構建與拓撲分析：將交集靶點導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構建PPI網(wǎng)絡并導入Cytoscape 3.9.0軟件可視化；通過CytoHubba插件篩選“Degree”值前20的核心靶點，利用MCODE插件進行模塊分析。

4. GO與KEGG富集分析：將交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫和OmicShare云平臺，進行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選Q值＜0.01的條目，可視化前20項結果。

分子對接驗證

1. 從PubChem數(shù)據(jù)庫下載木犀草素的3D結構，經(jīng)PyMOL軟件加氫、加電荷后保存為.pdbqt格式。

2. 從PDB數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點的X射線晶體結構，通過UCSF Chimera 1.14軟件去除配體和水分子，添加極性氫原子和Gasteiger電荷。

3. 以木犀草素為配體、核心靶點為受體，利用UCSF Chimera 1.14軟件進行分子對接，以結合能評價結合能力。

體內(nèi)實驗驗證

1. 動物分組與特應性皮炎模型構建：小鼠適應飼養(yǎng)1周后隨機分為4組：正常組、模型組、0.5%木犀草素組、0.05%地塞米松組。建模方法：第1天在小鼠背部脫毛區(qū)涂抹100μL 1.0% DNFB致敏；第3、7、11天涂抹100μL 0.5% DNFB激發(fā)；從第1天至第13天，木犀草素組和地塞米松組每日背部涂抹對應藥物，正常組和模型組涂抹等體積溶媒。

2. 指標檢測：

第13天進行SCORAD評分（評估紅斑/出血、鱗屑/干燥、水腫/腫脹、糜爛/抓痕，評分0-3分/項），計數(shù)10分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)；第12天用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀檢測TEWL值。

小鼠處死后，分離背部皮膚，用游標卡尺測厚度、分析天平測重量；取皮膚組織固定于4%多聚甲醛，包埋切片后進行H&E染色（檢測表皮厚度和炎癥細胞浸潤）、TB染色（檢測肥大細胞浸潤），ImageJ軟件定量分析。

收集小鼠眼球血，離心獲取血清；取100mg皮膚組織勻漿后離心獲取上清，BCA法測定蛋白濃度，ELISA試劑盒檢測血清和皮膚中Th1/Th2/Th17相關細胞因子水平。

皮膚組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復等步驟后，進行免疫組化和免疫熒光，ImageJ軟件分析平均光密度。

3. 統(tǒng)計分析：采用GraphPad Prism 5.0軟件，通過單因素方差分析結合Dunnett事后檢驗分析數(shù)據(jù)，P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

結論

木犀草素與特應性皮炎存在 31 個交集靶點，核心涵蓋 IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、IL-4 等 20 個關鍵基因，這些靶點主要參與細胞因子應答及相關信號通路，且 KEGG 富集分析明確其抗特應性皮炎的關鍵通路包括 IL-17 信號通路、Th17/Th1/Th2 細胞分化、JAK/STAT 信號通路等，分子對接也驗證了木犀草素與核心靶點的強結合能力。體內(nèi)實驗進一步證實，木犀草素能改善 DNFB 誘導的特應性皮炎小鼠模型的皮膚癥狀，不僅降低 SCORAD 評分、減少搔抓次數(shù)、減輕皮膚水腫（降低皮膚厚度和重量），還能改善組織病理學改變，減少表皮增生和炎癥細胞浸潤，降低顆粒型與脫顆粒型肥大細胞的浸潤數(shù)量；同時，它可有效恢復皮膚屏障功能，表現(xiàn)為降低 TEWL 值、上調 FLG 蛋白表達，還能調節(jié)免疫平衡，降低 Th2 相關細胞因子 IL-4 及 Th17 相關細胞因子 IL-6、TNF-α、IL-17 的水平，升高 Th1 相關細胞因子 IFN-γ 的水平。而這一系列作用的核心機制在于木犀草素能抑制 JAK2 和 STAT3 的磷酸化，阻斷 JAK/STAT 信號通路激活，為特應性皮炎的臨床治療提供了重要科學依據(jù)與潛在方向。

參考文獻：

1. Li H, Zhang Z, Zhang H, Guo Y, Yao Z. Update on the pathogenesis and therapy of atopic dermatitis. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):324–338. 

https://doi.org/10.1007/s12016-021-08880-3

2. Saini S, Pansare M. New insights and treatments in atopic dermatitis. Immunol Allergy Clin North Am. 2021;41(4):653–665.

https://doi.org/10.1016/j.iac.2021.07.005