本文由 東莞市譜標實驗器材科技有限公司 整理匯編

2013-11-11 00:00 353閱讀次數(shù)

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更多資料

• 酶聯(lián)免疫法實驗步驟

  酶聯(lián)免疫法實驗步驟[詳細]

  2013-11-11 00:00

  應用文章

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• 加A試劑盒實驗步驟

  利用具有3’-5’外切酶活性的高保真DNa聚合酶，如Pfu等進行PCR擴增時，其PCR產(chǎn)物為不帶A尾的平末端DNa片段，如想將該片段克隆到T載體上，需要先利用A-Tai領(lǐng)Enzyme在平末端片段后加上A尾后才能與T載體上3’末端的T堿基互補連接。本產(chǎn)品是在平末端DNa片段的3’末端添加一個A尾，使平末端的DNa片段進行TA克隆成為可能。本試劑盒提供了加A尾需要的所有成分，可以在30分鐘完成整個過程。與平末端DNa片段克隆相比，TA克隆具有較高的克隆效率，可大大提高實驗成功率。[詳細]

  2018-09-04 10:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 石油產(chǎn)品灰分測定儀實驗步驟

  1 準備工作 1.1 將稀鹽酸（1：4）注入所用的瓷坩堝（或瓷蒸發(fā)皿）內(nèi)煮沸幾分鐘，用蒸餾水洗滌。烘干后放在高溫爐中在775±25℃溫度下煅燒至少10分鐘，取出在空氣中冷卻3分鐘，移入干燥器中。冷卻至室溫后注，進行稱量，稱準至0.0001克。 重復進行煅燒、冷卻及稱量，直至連續(xù)兩次稱量間的差數(shù)不大于0.0005克為止。 注：一個干燥器中放一對坩堝為宜。放一對50毫升的坩堝，一般冷卻30~45分鐘可達到室溫；放一對100毫升的坩堝，一般冷卻45分鐘到1小時可達到室溫。坩堝一以冷卻就應進行稱量，坩堝在干燥器內(nèi)停留多長時間，則其后的所有稱量都應當讓其在干燥器內(nèi)停留同樣長的時間以后才進行。 1.2 取樣前將瓶中試樣（其量不得多于該瓶容積的3/4）劇烈搖動均勻，要確保所取試樣有真正的代表性。對粘稠的或含蠟的試樣需預先加熱至50～60℃。再搖動均勻后進行取樣。 2實驗步驟 2.1 將已經(jīng)恒重的坩堝稱量準確至0.1g，并以同樣的準確度稱入試樣。根據(jù)情況，一般可取25g試樣裝在50ml得坩堝內(nèi)進行試驗。所取試樣量的多少依試樣灰分含量的大小而定，以所取試樣能足以生成20mg的灰分為限，但[詳細]

  2024-09-12 17:12

  操作手冊

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• 紙箱抗壓機解決方案及實驗步驟

  紙箱抗壓機解決方案及實驗步驟[詳細]

  2016-05-07 00:00

  報價單

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• 紙箱抗壓機解決方案及實驗步驟

  紙箱抗壓機解決方案及實驗步驟[詳細]

  2016-04-23 00:00

  選購指南

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• 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)實驗步驟

  小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)實驗步驟[詳細]

  2015-03-24 00:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 潤滑油酸值測定實驗步驟

  酸值是表示油中含有酸性物質(zhì)的數(shù)量，中和1g油中的酸性物質(zhì)所需的氫氧化鉀的毫克數(shù)稱為酸值。酸值包括油中所含有機酸和無機酸，但在大多數(shù)情況下，油中不含無機酸。因此，油酸值實際上代表油中有機酸的含量。新油所含有機酸主要為環(huán)浣酸。在貯存和使用過程中，油因氧化而生成的有機酸為脂肪酸。酸值對于新油來說是精制程度的一種標志，對于運行油來說，則是油質(zhì)老化程度的一種標志，是判定油品是否能繼續(xù)使用的重要指標之一。 潤滑油油酸值測定實驗步驟： 1、儀器安裝在平穩(wěn)的工作臺上 2、把萃取液泵卡和軟管一起壓入液泵中，使之到位。（把手下端抬到刻度線處） 3、把滴定液泵卡和軟管壓入滴定液泵中，使之到位。（把手下端抬到刻度線處） 4、取出滴定液和萃取液的插管和瓶蓋，換上隨機帶的具有不銹鋼吸管的瓶蓋，旋緊。并把儀器上的滴定和中和分別對應的插入不銹鋼管、吸氣瓶中加入濃堿液，防止中和液與空氣反映影響測試結(jié)果。 5、把單相交流電源插入插座（注意：電源插座要有接地線，可靠接地。） 6、 取一定量的樣品 把樣品杯對應放入儀器內(nèi) 7、 在待測樣品中放入一攪拌子。 8、放入油樣后進行酸值測試。 9、測試結(jié)束后，把儀[詳細]

  2024-09-29 15:26

  操作手冊

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• 沖擊實驗方法與步驟

  沖擊實驗方法與步驟[詳細]

  2024-10-03 21:18

  專利

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• 血管生成實驗步驟－實驗方法完善版

  血管生成實驗步驟－實驗方法完善版[詳細]

  2016-03-29 00:00

  實驗操作

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• JAK1酶聯(lián)免疫分析操作步驟

  使用目的：本試劑盒用于測定血清、血漿及相關(guān)液體樣本中JAK1含量。JAK1酶聯(lián)免疫分析操作步驟實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中JAK1水平。用純化的JAK1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入JAK1，再與HRP標記的JAK1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的JAK1呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中JAK1濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶2酶標試劑6ml×1瓶8標準品（160pg/ml）0.5ml×1瓶3酶標包被板12孔×8條9標準品稀釋液1.5ml×1瓶4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個標本要求1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3YZ辣根過氧化物酶的（HRP）活性。JAK1酶聯(lián)免疫分析操作步驟操作步驟1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。80pg/ml5號標準品150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液40pg/ml4號標準品150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液20pg/ml3號標準品150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液10pg/ml2號標準品150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液5pg/ml1號標準品150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品Z終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。JAK1酶聯(lián)免疫分析操作步驟操作程序總結(jié)：計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。注意事項1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間**控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4．請每次測定的同時做標準曲線，**做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔**孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請Z后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物請避光保存。7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。9．本試劑不同批號組分不得混用。JAK1酶聯(lián)免疫分析操作步驟保存條件及有效期1．試劑盒保存：；2-8℃。2．有效期：6個月[詳細]

  2018-09-19 10:00

  產(chǎn)品樣冊

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• ELISA法測定肺炎衣原體實驗步驟

  ELISA法測定肺炎衣原體實驗步驟[詳細]

  2015-04-08 00:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 黃曲霉毒素B1的實驗步驟

  Normal07.8磅02falsefalsefalseMicrosoftInternetExplorer4黃曲霉毒素B1的實驗步驟、自備物品微孔板酶標儀（含450nm）、振蕩器、粉碎機、微量移液器、量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙、氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水。樣品處理取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化捺及250mL70%甲醇溶液，QL振蕩3min，用快速定性濾紙過濾。取50μL稀釋液進行分析。根據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應相應增加。實驗步驟1試劑盒平衡至室溫。取所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄樣品及標準的位置。2加入50μL標準品或處理好的樣品到微孔，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。3加入50μL抗AFB1單克隆抗體使用液到每個微孔，37℃避光孵育90min。4甩掉空中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，Z后一次應在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。5每孔加入酶標物100μL，37℃避光孵育60min。6用洗液洗滌微孔板3min×3次，Z后一次應在吸水紙上拍打已完全除去孔液體。7沒空加入顯色液100μL（2滴），37℃避光孵育10min。8每孔加入終止液50μL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD）值。測定1目測法：未加終止液前目測。比較樣品孔與標準1的微孔顏色，若淺，則為陽性；若深，則為陰性；顏色接近則需用酶標儀測吸光度值比較。2儀器法：用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值。[詳細]

  2018-11-15 10:03

  產(chǎn)品樣冊

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• ELISA實驗原理、步驟、問題分析

  上海恒遠生物科技有限公司專業(yè)供應各種屬elisa試劑盒，提供免費代測服務，保證實驗結(jié)果客觀真實性。我公司對試劑盒質(zhì)量1**%保證，若存在質(zhì)量問題，我們無條件包退換。若需要了解試劑盒的詳細信息，請來的咨詢：電話：021-6052049813636351217業(yè)務QQ:1005074258何經(jīng)理ELISA實驗原理、步驟、ELISA問題分析ELISA實驗原理酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度類型及步驟ELISA的主要常用類型及步驟1.間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的樣本，保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結(jié)合，從而間接記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。2.雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原Z常用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢樣本，保溫反應。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。3.雙抗原夾心法測抗體反應原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體4.競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，Z后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。ELISAQ&A如何選擇合適的陽性對照?陽性對照的基本組成應該盡量與檢測樣本的組成一致，一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，加入一定量的待檢物質(zhì)。比如，以人血清為標本的測定，陽性對照多用確定的病人血清或者以復鈣人血漿為原料加入一定量標準品。如何選擇合適的陰性對照?陰性對照的基本組成也應該盡量與檢測樣本的組成一致，**先行檢測確定其中不含待檢物質(zhì)。比如，檢測人血清標本時，陰性對照應該選擇正常人血清;檢測免疫動物血清中抗體效價時，陰性對照應該選擇該動物的免疫前血清。如何選擇Zyou化的包被條件?1.包被抗原的選擇包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標板上，再通過特異性反應使抗原固相化）。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標板上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。4.包被濃度的選擇包被的Z適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包被抗原的Z適包被濃度需要通過實驗來確定。包板后需要封閉嗎?應該選擇什么樣的封閉體系?封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測定中，封閉一般是必不可少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價廉而且封閉能力強，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜長期保存，所以試劑盒中較少使用。如何正確使用酶結(jié)合物?1.酶結(jié)合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%BSA或5%脫脂奶粉），通過競爭YZ酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠YZ蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）。2.正確稀釋酶結(jié)合物酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預實驗來確定，濃度過高易導致本底偏高，濃度過低則會導致陽性信號的減弱。酶結(jié)合物**在使用前稀釋，稀釋后的酶結(jié)合物不宜長期保存，因為低濃度的酶結(jié)合物極易失活。問題可能的原因解決方法陰性對照產(chǎn)生了陽性的結(jié)果試劑或者耗材污染更換試劑，使用一次性耗材洗板出現(xiàn)問題更換更強配方的洗滌液，增加洗板次數(shù)，延長洗板時間如果是在雙抗體夾心法中出現(xiàn)，有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應更換包被抗體或二抗使用了過多的抗體減少抗體使用量整板出現(xiàn)高背景二抗產(chǎn)生了非特異性吸附減少二抗使用量，縮短二抗反應時間顯色液不新鮮使用現(xiàn)配的顯色液顯色反應時間過長沒有終止控制顯色反應時間，及時終止反應試劑或者耗材污染更換試劑，使用一次性耗材反應溫度過高導致的非特異性吸附嚴格控制反應在Z適溫度下進行封閉條件不佳導致的非特異性吸附更換封閉能力更強的封閉液，延長封閉時間反應信號偏低包被條件不合適提高包板濃度，延長包板時間抗原抗體反應不夠充分延長反應時間，確保反應在Z適溫度下進行顯色液配方不恰當增加顯色底物的量二抗結(jié)合不夠提高二抗?jié)舛?，延長反應時間，更換效果更好的二抗梯度稀釋做ELISA時產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象酶標板疊放導致傳熱不均勻，各孔反應溫度有差異盡量避免酶標板疊放在一起移液器稀釋時未能保持連續(xù)性定期校準移液器，確保移液器的正確使用反應溶液蒸發(fā)酶標板用封條密封或者加蓋洗板不均勻確定洗板機能夠正常工作酶標板底有雜物或者水珠讀板時清理干凈酶標板底部[詳細]

  2018-11-16 10:02

  產(chǎn)品樣冊

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• 石油產(chǎn)品熱值檢測儀的實驗步驟

  汽油熱值測定儀試驗步驟 1、準備內(nèi)筒水： 適當調(diào)節(jié)小筒水溫，一般要使小筒水溫低于外筒溫度1K左右，這樣才能到試驗終點時內(nèi)筒比外筒高1K左右，作標定或測發(fā)熱量做平行樣時。 2、準備氧彈 將饒制好的點火絲緊固在氧彈的兩個點火電極上，確保接觸良好,點火絲的阻值一般取4～6Ω。 3、將小筒小心放入套筒中,把氧彈平穩(wěn)放入小筒的支腳上，輕輕合上上蓋，使上蓋上的ZX電極與氧彈彈頭良好接觸，否則可通過調(diào)節(jié)ZX電極螺釘露出長度來實現(xiàn)。調(diào)節(jié)好后，上蓋壓下時密封圈圓周與方箱上面應均勻接觸。 4、選擇試驗的項目（標定或測量），輸入試樣數(shù)據(jù)，開始進行試驗。整個試驗過程參見上述相關(guān)內(nèi)容。 5、試驗結(jié)束，屏幕顯示試驗結(jié)果，當打印選項設(shè)為“自動”時，還將自動打印輸出試驗報告。 6、掀起上蓋，取出小筒和氧彈將氧彈放氣后打開進行清洗，為下一次試驗作準備。[詳細]

  2020-06-09 19:47

  操作手冊

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• 蛋白鹽析實驗步驟及注意事項

  蛋白鹽析實驗步驟及注意事項[詳細]

  2024-09-28 15:14

  報價單

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• 雞ALV-J酶聯(lián)免疫試劑盒使用步驟

  雞ALV-J酶聯(lián)免疫試劑盒使用步驟[詳細]

  2015-07-02 00:00

  期刊論文

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• 大鼠多巴胺ELISA檢測試劑盒實驗步驟

  大鼠多巴胺ELISA檢測試劑盒實驗步驟[詳細]

  2015-04-21 00:00

  操作手冊

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• 腫瘤細胞侵襲實驗原理 材料 步驟

  一原理Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以BDFalcon細胞小室上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細胞，具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。細胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細胞數(shù)。另外用BDFalcon細胞小室也可進行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在BDFalcon細胞小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細胞在BDFalcon細胞小室中培養(yǎng)72小時后，有相當數(shù)量穿過濾膜的細胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進人下腔溶液中．因此統(tǒng)計穿過基質(zhì)膜的細胞數(shù)目時應把這部分細胞考慮在內(nèi)。腫瘤細胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細胞通過變形運動穿過濾膜，用這種模型對分析細胞運動能力和藥物對細胞運動能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對腫瘤細胞的趨化性或趨固性的影響。二材料1.Matrigel基質(zhì)膠（BDBIOCOAT#356234），5ml，分裝成0.5ml/只10個EP管中；用時加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時可迅速凝結(jié)成膠。使用前應從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），避免反復凍融。使用時需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應預冷于4℃；注意無菌操作；2.8ul，24孔配套細胞小室（BDFaclon#353097）；3.結(jié)晶紫染料溶液：結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用濃度為0.1％，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；4.33%醋酸；1.溶液配制：（1）.溶DMEM500ml；NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）母液0.1ml（5mg）+ddH2Oupto5ml；過濾消毒，-20℃保存。NE-DMEM（-6M）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（2）.NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlCGRP-儲存液50μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（3）.NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlIFN-γ（25ng/μl）25μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（4）.低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）（5）.20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）2.準備（1）.溶膠，4℃過夜（ThawMatrigelat4℃overnight.）（2）.室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗前-20C預冷。（Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.）3.包被基底膜（冰上操作）（1）.用無血清的冷細胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/mlto5mg/ml））（DiluteMatrigel（10mg/mlto5mg/ml）inserumfree-coldcellculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEM,etc）.）（2）.取100ul稀釋膠加到24-well細胞小室的上室中（Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell）（3）.37℃孵育transwell至少4-5h（Incubatethetranswellat37Catleast4to5hforgel領(lǐng).）4.水化基底膜用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠（Gentlywashgelledmatrigelwithwarmedserumfree-culturemedia.）5.準備細胞懸液和小室（1）.消化法從細胞培養(yǎng)瓶中獲取細胞；（HarvestcellsfromtissuecultureflasksbyTrypsin/EDTA；）（2）.用培養(yǎng)基洗3遍（Washthecells3timeswithculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEMetc）containing1%FBS.）（3）.重選細胞，5×105cells/ml，1%FBS（Resuspendthecellsinmediacontaining1%FBSatadensityof5×105cells/ml.）（4）.上室加200ul細胞懸液（Put200ulofthecellsuspensionontothematrigel.）（5）.下室中加入600ul細胞培養(yǎng)基，含有5ug/mlfibronectin作為黏連亞族（lowerchamberofthetranswellisfilledwith600ulofculturemediacontaining,asanadhesivesubtrate.）6.孵育，37℃，20to24h（Incubateat37Cfor20to24h.7.染色和計數(shù)（1）.棉簽擦去上室上面的非侵襲細胞（Scrapeoffnoninvadedcellsonthetopofthetranswellwithacottonswab）（2）.移去transwells，倒置，風干（Removetranswellsfrom24-wellplatesandstainedwithDiff-Quicksolution.）（3）.24孔板中加入500l含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃30min后取出，PBS清洗。（4）.直徑上取4個視野，照相，計數(shù)。（5）.24孔板中加入500l33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上570nm測OD值，間接反應細胞數(shù)。小技巧：照相前一定要晾干，照相時將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。經(jīng)濟、實用、方便。[詳細]

  2018-09-02 10:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 還原糖含量的測定實驗步驟

  還原糖含量的測定實驗步驟[詳細]

  2024-09-22 18:50

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