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石油產(chǎn)品灰分測(cè)定儀實(shí)驗(yàn)步驟
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2024-09-12 17:12 1068閱讀次數(shù)
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1 準(zhǔn)備工作
1.1 將稀鹽酸(1:4)注入所用的瓷坩堝(或瓷蒸發(fā)皿)內(nèi)煮沸幾分鐘,用蒸餾水洗滌。烘干后放在高溫爐中在775±25℃溫度下煅燒至少10分鐘,取出在空氣中冷卻3分鐘,移入干燥器中。冷卻至室溫后注,進(jìn)行稱量,稱準(zhǔn)至0.0001克。
重復(fù)進(jìn)行煅燒、冷卻及稱量,直至連續(xù)兩次稱量間的差數(shù)不大于0.0005克為止。
注:一個(gè)干燥器中放一對(duì)坩堝為宜。放一對(duì)50毫升的坩堝,一般冷卻30~45分鐘可達(dá)到室溫;放一對(duì)100毫升的坩堝,一般冷卻45分鐘到1小時(shí)可達(dá)到室溫。坩堝一以冷卻就應(yīng)進(jìn)行稱量,坩堝在干燥器內(nèi)停留多長(zhǎng)時(shí)間,則其后的所有稱量都應(yīng)當(dāng)讓其在干燥器內(nèi)停留同樣長(zhǎng)的時(shí)間以后才進(jìn)行。
1.2 取樣前將瓶中試樣(其量不得多于該瓶容積的3/4)劇烈搖動(dòng)均勻,要確保所取試樣有真正的代表性。對(duì)粘稠的或含蠟的試樣需預(yù)先加熱至50~60℃。再搖動(dòng)均勻后進(jìn)行取樣。
2實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 將已經(jīng)恒重的坩堝稱量準(zhǔn)確至0.1g,并以同樣的準(zhǔn)確度稱入試樣。根據(jù)情況,一般可取25g試樣裝在50ml得坩堝內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。所取試樣量的多少依試樣灰分含量的大小而定,以所取試樣能足以生成20mg的灰分為限,但
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石油產(chǎn)品灰分測(cè)定儀實(shí)驗(yàn)步驟
- 1 準(zhǔn)備工作
1.1 將稀鹽酸(1:4)注入所用的瓷坩堝(或瓷蒸發(fā)皿)內(nèi)煮沸幾分鐘,用蒸餾水洗滌。烘干后放在高溫爐中在775±25℃溫度下煅燒至少10分鐘,取出在空氣中冷卻3分鐘,移入干燥器中。冷卻至室溫后注,進(jìn)行稱量,稱準(zhǔn)至0.0001克。
重復(fù)進(jìn)行煅燒、冷卻及稱量,直至連續(xù)兩次稱量間的差數(shù)不大于0.0005克為止。
注:一個(gè)干燥器中放一對(duì)坩堝為宜。放一對(duì)50毫升的坩堝,一般冷卻30~45分鐘可達(dá)到室溫;放一對(duì)100毫升的坩堝,一般冷卻45分鐘到1小時(shí)可達(dá)到室溫。坩堝一以冷卻就應(yīng)進(jìn)行稱量,坩堝在干燥器內(nèi)停留多長(zhǎng)時(shí)間,則其后的所有稱量都應(yīng)當(dāng)讓其在干燥器內(nèi)停留同樣長(zhǎng)的時(shí)間以后才進(jìn)行。
1.2 取樣前將瓶中試樣(其量不得多于該瓶容積的3/4)劇烈搖動(dòng)均勻,要確保所取試樣有真正的代表性。對(duì)粘稠的或含蠟的試樣需預(yù)先加熱至50~60℃。再搖動(dòng)均勻后進(jìn)行取樣。
2實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 將已經(jīng)恒重的坩堝稱量準(zhǔn)確至0.1g,并以同樣的準(zhǔn)確度稱入試樣。根據(jù)情況,一般可取25g試樣裝在50ml得坩堝內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。所取試樣量的多少依試樣灰分含量的大小而定,以所取試樣能足以生成20mg的灰分為限,但[詳細(xì)]
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2024-09-12 17:12
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石油產(chǎn)品灰分測(cè)定儀
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1、準(zhǔn)備內(nèi)筒水:
適當(dāng)調(diào)節(jié)小筒水溫,一般要使小筒水溫低于外筒溫度1K左右,這樣才能到試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)內(nèi)筒比外筒高1K左右,作標(biāo)定或測(cè)發(fā)熱量做平行樣時(shí)。
2、準(zhǔn)備氧彈
將饒制好的點(diǎn)火絲緊固在氧彈的兩個(gè)點(diǎn)火電極上,確保接觸良好,點(diǎn)火絲的阻值一般取4~6Ω。
3、將小筒小心放入套筒中,把氧彈平穩(wěn)放入小筒的支腳上,輕輕合上上蓋,使上蓋上的ZX電極與氧彈彈頭良好接觸,否則可通過調(diào)節(jié)ZX電極螺釘露出長(zhǎng)度來實(shí)現(xiàn)。調(diào)節(jié)好后,上蓋壓下時(shí)密封圈圓周與方箱上面應(yīng)均勻接觸。
4、選擇試驗(yàn)的項(xiàng)目(標(biāo)定或測(cè)量),輸入試樣數(shù)據(jù),開始進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)過程參見上述相關(guān)內(nèi)容。
5、試驗(yàn)結(jié)束,屏幕顯示試驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)打印選項(xiàng)設(shè)為“自動(dòng)”時(shí),還將自動(dòng)打印輸出試驗(yàn)報(bào)告。
6、掀起上蓋,取出小筒和氧彈將氧彈放氣后打開進(jìn)行清洗,為下一次試驗(yàn)作準(zhǔn)備。[詳細(xì)]
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潤(rùn)滑油酸值測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟
- 酸值是表示油中含有酸性物質(zhì)的數(shù)量,中和1g油中的酸性物質(zhì)所需的氫氧化鉀的毫克數(shù)稱為酸值。酸值包括油中所含有機(jī)酸和無機(jī)酸,但在大多數(shù)情況下,油中不含無機(jī)酸。因此,油酸值實(shí)際上代表油中有機(jī)酸的含量。新油所含有機(jī)酸主要為環(huán)浣酸。在貯存和使用過程中,油因氧化而生成的有機(jī)酸為脂肪酸。酸值對(duì)于新油來說是精制程度的一種標(biāo)志,對(duì)于運(yùn)行油來說,則是油質(zhì)老化程度的一種標(biāo)志,是判定油品是否能繼續(xù)使用的重要指標(biāo)之一。
潤(rùn)滑油油酸值測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟:
1、儀器安裝在平穩(wěn)的工作臺(tái)上
2、把萃取液泵卡和軟管一起壓入液泵中,使之到位。(把手下端抬到刻度線處)
3、把滴定液泵卡和軟管壓入滴定液泵中,使之到位。(把手下端抬到刻度線處)
4、取出滴定液和萃取液的插管和瓶蓋,換上隨機(jī)帶的具有不銹鋼吸管的瓶蓋,旋緊。并把儀器上的滴定和中和分別對(duì)應(yīng)的插入不銹鋼管、吸氣瓶中加入濃堿液,防止中和液與空氣反映影響測(cè)試結(jié)果。
5、把單相交流電源插入插座(注意:電源插座要有接地線,可靠接地。)
6、 取一定量的樣品 把樣品杯對(duì)應(yīng)放入儀器內(nèi)
7、 在待測(cè)樣品中放入一攪拌子。
8、放入油樣后進(jìn)行酸值測(cè)試。
9、測(cè)試結(jié)束后,把儀[詳細(xì)]
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黃曲霉毒素B1的實(shí)驗(yàn)步驟
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ELISA實(shí)驗(yàn)原理、步驟、問題分析
- 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司專業(yè)供應(yīng)各種屬elisa試劑盒,提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù),保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀真實(shí)性。我公司對(duì)試劑盒質(zhì)量1**%保證,若存在質(zhì)量問題,我們無條件包退換。若需要了解試劑盒的詳細(xì)信息,請(qǐng)來的咨詢:電話:021-6052049813636351217業(yè)務(wù)QQ:1005074258何經(jīng)理ELISA實(shí)驗(yàn)原理、步驟、ELISA問題分析ELISA實(shí)驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量測(cè)定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度類型及步驟ELISA的主要常用類型及步驟1.間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(二抗)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原,洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2)加稀釋的樣本,保溫反應(yīng)。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3)加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合,從而間接記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。4)加底物顯色。2.雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原Z常用的方法,操作步驟如下:1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2)加受檢樣本,保溫反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3)加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。4)加底物顯色。3.雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體4.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,Z后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。ELISAQ&A如何選擇合適的陽性對(duì)照?陽性對(duì)照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,一般陽性對(duì)照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),加入一定量的待檢物質(zhì)。比如,以人血清為標(biāo)本的測(cè)定,陽性對(duì)照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品。如何選擇合適的陰性對(duì)照?陰性對(duì)照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,**先行檢測(cè)確定其中不含待檢物質(zhì)。比如,檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清。如何選擇Zyou化的包被條件?1.包被抗原的選擇包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被,對(duì)于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上,再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化)。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上,一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián),偶聯(lián)物吸附于固相載體上。2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話,也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時(shí),我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白活性的保持。4.包被濃度的選擇包被的Z適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化,一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml,要明確針對(duì)特定包被抗原的Z適包被濃度需要通過實(shí)驗(yàn)來確定。包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操作時(shí)洗滌徹底,不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測(cè)定中,封閉一般是必不可少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,AbMART推薦使用5%脫脂奶粉,價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng),不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用,不宜長(zhǎng)期保存,所以試劑盒中較少使用。如何正確使用酶結(jié)合物?1.酶結(jié)合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%BSA或5%脫脂奶粉),通過競(jìng)爭(zhēng)YZ酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠YZ蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20(0.05%的濃度較為適宜)。2.正確稀釋酶結(jié)合物酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定,濃度過高易導(dǎo)致本底偏高,濃度過低則會(huì)導(dǎo)致陽性信號(hào)的減弱。酶結(jié)合物**在使用前稀釋,稀釋后的酶結(jié)合物不宜長(zhǎng)期保存,因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活。問題可能的原因解決方法陰性對(duì)照產(chǎn)生了陽性的結(jié)果試劑或者耗材污染更換試劑,使用一次性耗材洗板出現(xiàn)問題更換更強(qiáng)配方的洗滌液,增加洗板次數(shù),延長(zhǎng)洗板時(shí)間如果是在雙抗體夾心法中出現(xiàn),有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應(yīng)更換包被抗體或二抗使用了過多的抗體減少抗體使用量整板出現(xiàn)高背景二抗產(chǎn)生了非特異性吸附減少二抗使用量,縮短二抗反應(yīng)時(shí)間顯色液不新鮮使用現(xiàn)配的顯色液顯色反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)沒有終止控制顯色反應(yīng)時(shí)間,及時(shí)終止反應(yīng)試劑或者耗材污染更換試劑,使用一次性耗材反應(yīng)溫度過高導(dǎo)致的非特異性吸附嚴(yán)格控制反應(yīng)在Z適溫度下進(jìn)行封閉條件不佳導(dǎo)致的非特異性吸附更換封閉能力更強(qiáng)的封閉液,延長(zhǎng)封閉時(shí)間反應(yīng)信號(hào)偏低包被條件不合適提高包板濃度,延長(zhǎng)包板時(shí)間抗原抗體反應(yīng)不夠充分延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,確保反應(yīng)在Z適溫度下進(jìn)行顯色液配方不恰當(dāng)增加顯色底物的量二抗結(jié)合不夠提高二抗?jié)舛?,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,更換效果更好的二抗梯度稀釋做ELISA時(shí)產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象酶標(biāo)板疊放導(dǎo)致傳熱不均勻,各孔反應(yīng)溫度有差異盡量避免酶標(biāo)板疊放在一起移液器稀釋時(shí)未能保持連續(xù)性定期校準(zhǔn)移液器,確保移液器的正確使用反應(yīng)溶液蒸發(fā)酶標(biāo)板用封條密封或者加蓋洗板不均勻確定洗板機(jī)能夠正常工作酶標(biāo)板底有雜物或者水珠讀板時(shí)清理干凈酶標(biāo)板底部[詳細(xì)]
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2018-11-16 10:02
產(chǎn)品樣冊(cè)
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蛋白鹽析實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)
- 蛋白鹽析實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)[詳細(xì)]
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2024-09-28 15:14
報(bào)價(jià)單
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便攜式煤灰分測(cè)定儀 型號(hào):MHY-26520
- 便攜式智能快灰儀/便攜式煤灰分測(cè)定儀型號(hào):MHY-26520便攜式智能快灰儀采用新型輕質(zhì)材料,價(jià)格合理,結(jié)構(gòu)新穎、外形美觀、升溫快速,恒溫性能優(yōu)異,尤其是改變了傳統(tǒng)儀器笨重不方便移動(dòng)。廣泛用于煤炭、冶金、電力、化工、建材、制藥、科研等行業(yè)和部門進(jìn)行揮發(fā)分、灰分、羅加指數(shù)、粘結(jié)指數(shù)、煤的工業(yè)分析和工業(yè)熱處理。采用優(yōu)質(zhì)的真空纖維爐膛保溫郊果好,升溫速度快,節(jié)能電顯著,與傳統(tǒng)馬弗爐相比,節(jié)約電能2/3。Z高爐溫:1000℃升溫時(shí)間(0-920℃)約為9-15min重量:約20KG額定功率:1KW爐膛尺寸:120×120×210(mm)[詳細(xì)]
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2024-09-12 16:13
產(chǎn)品樣冊(cè)
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大鼠多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟
- 大鼠多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟[詳細(xì)]
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2015-04-21 00:00
操作手冊(cè)
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腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)原理 材料 步驟
- 一原理Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分,含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖,鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上,能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu),這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um,而且膜孔都被Matrigel覆蓋,細(xì)胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜,這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以BDFalcon細(xì)胞小室上下室之間,鋪有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趨化劑,如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液,上室加入重懸的瘤細(xì)胞,具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān),選擇25ugMartrigell鋪膜,16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面,可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去,然后用乙醇固定濾膜,PE染色,在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用BDFalcon細(xì)胞小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析,這一方法是在BDFalcon細(xì)胞小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel,加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是,細(xì)胞在BDFalcon細(xì)胞小室中培養(yǎng)72小時(shí)后,有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面,而是脫落進(jìn)人下腔溶液中.因此統(tǒng)計(jì)穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性,可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。在上述分析中,如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間,細(xì)胞通過變形運(yùn)動(dòng)穿過濾膜,用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外,在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN,可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。二材料1.Matrigel基質(zhì)膠(BDBIOCOAT#356234),5ml,分裝成0.5ml/只10個(gè)EP管中;用時(shí)加入0.5ml的DMEM;Matrivgel在冰上維持液態(tài),室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。使用前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化(如過夜放置),避免反復(fù)凍融。使用時(shí)需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃;注意無菌操作;2.8ul,24孔配套細(xì)胞小室(BDFaclon#353097);3.結(jié)晶紫染料溶液:結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液,使用濃度為0.1%,用PBS按1:4稀釋后即為染色液;4.33%醋酸;1.溶液配制:(1).溶DMEM500ml;NE---A液(1μg/μl,1mg/ml)母液0.1ml(5mg)+ddH2Oupto5ml;過濾消毒,-20℃保存。NE-DMEM(-6M)NE---A液(1μg/μl,1mg/ml)20.5μlDMEMUPTO100ml過濾消毒,4℃保存(2).NE+CGRP-DMEM(-6M,100ng)NE---A液(1μg/μl,1mg/ml)20.5μlCGRP-儲(chǔ)存液50μlDMEMUPTO100ml過濾消毒,4℃保存(3).NE+IFN-DMEM(-6M,50ng)NE---A液(1μg/μl,1mg/ml)20.5μlIFN-γ(25ng/μl)25μlDMEMUPTO100ml過濾消毒,4℃保存(4).低血清DMEM培養(yǎng)基(上室)(5).20%FBS-DMEM培養(yǎng)基(下室)2.準(zhǔn)備(1).溶膠,4℃過夜(ThawMatrigelat4℃overnight.)(2).室溫下基質(zhì)膠易成凝膠,所以,步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。(Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.)3.包被基底膜(冰上操作)(1).用無血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠(10mg/mlto5mg/ml))(DiluteMatrigel(10mg/mlto5mg/ml)inserumfree-coldcellculturemedia(RPMI1640,EMEM,DMEM,etc).)(2).取100ul稀釋膠加到24-well細(xì)胞小室的上室中(Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell)(3).37℃孵育transwell至少4-5h(Incubatethetranswellat37Catleast4to5hforgel領(lǐng).)4.水化基底膜用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠(Gentlywashgelledmatrigelwithwarmedserumfree-culturemedia.)5.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室(1).消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞;(HarvestcellsfromtissuecultureflasksbyTrypsin/EDTA;)(2).用培養(yǎng)基洗3遍(Washthecells3timeswithculturemedia(RPMI1640,EMEM,DMEMetc)containing1%FBS.)(3).重選細(xì)胞,5×105cells/ml,1%FBS(Resuspendthecellsinmediacontaining1%FBSatadensityof5×105cells/ml.)(4).上室加200ul細(xì)胞懸液(Put200ulofthecellsuspensionontothematrigel.)(5).下室中加入600ul細(xì)胞培養(yǎng)基,含有5ug/mlfibronectin作為黏連亞族(lowerchamberofthetranswellisfilledwith600ulofculturemediacontaining,asanadhesivesubtrate.)6.孵育,37℃,20to24h(Incubateat37Cfor20to24h.7.染色和計(jì)數(shù)(1).棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞(Scrapeoffnoninvadedcellsonthetopofthetranswellwithacottonswab)(2).移去transwells,倒置,風(fēng)干(Removetranswellsfrom24-wellplatesandstainedwithDiff-Quicksolution.)(3).24孔板中加入500l含0.1%結(jié)晶紫,將小室置于其中,使膜浸沒在培養(yǎng)基中,37℃30min后取出,PBS清洗。(4).直徑上取4個(gè)視野,照相,計(jì)數(shù)。(5).24孔板中加入500l33%醋酸,將小室置于其中,浸膜,振蕩10min,充分溶解。取出小室,24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)OD值,間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。小技巧:照相前一定要晾干,照相時(shí)將小室正置于載玻片上,在倒置顯微鏡下觀察、照相。經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便。[詳細(xì)]
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2018-09-02 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
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