本文由 上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司 整理匯編

2018-09-29 10:03 1249閱讀次數(shù)

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• Clontech酵母雙雜交系統(tǒng) pCL1說明書

  MATCHMAKERGAL4Two-HybridVectorsHandbookpCL1型號(hào)載體名稱出品公司載體用途VJC0484pCL1Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)產(chǎn)品參數(shù):測(cè)序引物：CMV-F載體抗性:氨芐青霉素（Ampicillin）載體描述:pCL1isapositivecontrolplasmidthatencodesthefulllength,wild-typeGAL4protein.TheGAL4proteinactivatesreportergenesunderthecontrolofaGAL4-responsiveelement（UASG）.Thus,pCL1isusedasapositivecontrolforthetranscriptionassayinGAL4-basedMATCHMAKERTwo-HybridSystems.ThisvectorisaderivativeofYCp50referencedinFields&Song,1989.pCL1hasnotbeensequenced.質(zhì)粒圖譜:[詳細(xì)]

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• Clontech 酵母雙雜交系統(tǒng) pGBKT7說明書

  Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)pGBKT7，酵母雙雜交系統(tǒng)pGBKT7，ClontechpGBKT7pGBKT7產(chǎn)品參數(shù):MammalianSelection：TRP1（HIS3selection）載體抗性:卡那霉素（Kanamycin）說明書:質(zhì)粒圖譜:[詳細(xì)]

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• Clontech pBridge酵母三雜交系統(tǒng)說明書

  ClontechpBridge酵母三雜交系統(tǒng)說明書載體描述:pBridgeexpressestwoproteins:aDNA-bindingdomainfusion,andanadditionalprotein.pBridgethusallowsestablishmentofthree-hybridsystemswhenusedincombinationwithanactivationdomainfusionvectorandyeaststrainsfromanyofClontech'sGAL4-basedtwo-hybridsystems,includingMatchmakerGold.ThisvectorgeneratesahybridproteinthatcontainsthesequencesfortheGAL4DNA-bindingdomain（DNA-BD）andthesequenceclonedintoMCSI.ThefusionproteinisexpressedinyeasthostcellsfromtheconstitutiveADH1promoter;transcriptionisterminatedattheADH1transcriptionterminationsignal.Thehybridproteinistargetedtotheyeastnucleusbynuclearlocalizationsequences（NLS）thatareanintrinsicpartoftheGAL4DNA-BD.AnadditionalgeneofinterestcanbeclonedintoMCSIIwhichislocateddownstreamofanHAepitopeandasecondNLS.TheresultingfusionproteinisconditionallyexpressedfromtheMet25promoterinresponsetomethioninelevelsinthemedium;i.e.,itisrepressedinthepresenceof1mMmethionineandexpressedintheabsenceofmethionine.質(zhì)粒圖譜:[詳細(xì)]

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• 酵母單雜交系統(tǒng)Clontech pHis2說明書

  酵母單雜交系統(tǒng)ClontechpHis2說明書DescriptionpHIS2isareportervectorthatcanbeusedinyeastone-hybridassaystoidentifyandcharacterizeDNA-bindingproteins.ThevectorwasspecificallydesignedforusewiththeBDMatchmakerOne-HybridLibraryConstruction&ScreeningKit（#K1617-1）.ItcontainsaHIS3nutritionalreportergene,locateddownstreamofamultiplecloningsite（MCS）andtheminimalpromoteroftheHIS3locus（PminHIS3）.Cis-actingDNAsequences,orDNAtargetelements,canbeinsertedintotheMCSandusedasbaitstoscreenGAL4AD/cDNAfusionlibrariesforproteinsthatinteractwiththetargetsequence.Aprotein-DNA（orone-hybrid）interactioncanbedetectedbyperformingtheassayinayeaststrainsuchasY187thatisauxotrophicforhistidine.Positiveone-hybridinteractionsdriveexpressionoftheHIS3reportergene,whichenablesthehostcelltogrowonhistidine-deficientmedia.Intheabsenceofactivation,theconstitutiveHIS3expressionfromPminHIS3isverylow.Duringlibraryscreening,theleakyexpressionofHIS3iscontrolledbyadding3-amino-1,2,4-triazole（3-AT）tothemedium.Theconcentrationof3-ATneededtofullysuppressleakyHIS3expressionmustbedeterminedempiricallyforeachDNAtargetelement.pHIS2canbemaintainedinbothyeastandbacteria.Itcontainsanautonomousreplicationsequence（ARS4）andTRP1nutritionalmarkerforreplicationandselectioninyeast（1,2）;itcontainsaColE1originandakanamycinresistancegene（Kanr）forpropagationandselectioninE.coli.ThecentromericsequenceCEN6ensurespropersegregationoftheplasmidduringcelldivisioninyeast（1,2）.UseTousepHIS2inaone-hybridassay,cloneoneormorecopiesofacis-actingDNAtargetsequenceintotheMCS.ThenintroducetheplasmidintocompetentyeastcellsusingthetransformationprotocolintheBDMatchmakerLibraryConstruction&ScreeningKitsUserManual（PT3529-1）.IncontrasttotheoriginalBDMatchmakerOne-HybridSystem,thisreportervectordoesnotneedtobeintegratedintotheyeastgenome.Instead,itismaintainedasanepisomethroughouttheassay.InsertingyourtargetelementmayalterthelevelofbackgroundHIS3expression.Therefore,constructs首ldbetestedforbackground（leaky）HIS3expressionbeforeyoustartaone-hybridanalysis.BackgroundgrowthduetoleakyHIS3expressioniscontrolledbyadding3-ATtotheselectionmedium,asdescribedintheUserManual（PT3529-1）.LocationofFeaturesMultiplecloningsites:141HIS3gene:152811FragmentcontainingtheHIS33'UTR&Terminationsequence:8121446TRP1gene:28553529FragmentcontainingtheColE1E.colioriginofreplication:41654615Kanamycin-resistancegene:56054811CEN6/ARS4sequences:62545737[詳細(xì)]

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• 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展

  酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展[詳細(xì)]

  2015-04-01 00:00

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• Promega CheckMate 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng) 說明書

  在生物技術(shù)這個(gè)年輕的領(lǐng)域中，Promega公司進(jìn)駐ZG已有26年的歷史。這26年，Promega與國(guó)內(nèi)科學(xué)家共同見證了ZG生命科學(xué)的飛速崛起，并將創(chuàng)新的技術(shù)、精良的產(chǎn)品和wan美的服務(wù)不斷提供給ZG生命科學(xué)用戶，與廣大dai理商真誠(chéng)合作和共同發(fā)展。隨著ZG政府對(duì)基礎(chǔ)研究和知識(shí)創(chuàng)新的大量投入，國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域高素質(zhì)科研團(tuán)隊(duì)不斷成熟和壯大，普洛麥格公司將會(huì)有更大的發(fā)展空間。未來普洛麥格公司將更有效地運(yùn)用“為生命而極ng確設(shè)計(jì)”的工具和手段，協(xié)助推動(dòng)ZG生命科學(xué)研究的進(jìn)步。哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)PromegaVectors：pACT，pBINDContorlplasmid：pACT-MyoD，pBIND-IdReporterplasmid：pG5luc[詳細(xì)]

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• Clontech AH109說明書

  ClontechAH109說明書，AH109說明書，ClontechAH109AH109型號(hào)載體名稱出品公司載體用途VNC0491AH109Clontech配套釀酒酵母hissectionprovidesdetailedphenotypesoftheyeaststrainsincludedwithMATCHMAKERSystem3andMATCHMAKERGAL4cDNAandGenomicLibraries.Foradditionalinformationonthegrowthandmaintenanceofyeast,seetheYPH,ChapterIII.WealsorecommendGuthrie&Fink’sGuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology（1991）andHeslot&Gailardin’sMolecularBiologyandGeneticEngineeringofYeasts（1992）.A.YeastHostStrainsThecompletegenotypesofAH109,Y187,andCG-1945areprovidedinTableII.Allstrainsaregal4andgal80;thispreventsinterferenceofnativeregulatoryproteinswiththeregulatoryelementsinthetwo-hybridsystem.1.UseAH109asthehoststrainifyouplantoscreenanAD/libraryusingHIS3,ADE2,andMEL1.2.System3UsersOnly:UseY187asthehoststrainifyouplantotestforaninteractionbetweentwoknownproteinsusingthelacZreporteronly.Inaddition,useY187asamatingpartnertoverifyproteininteractions.3.LibraryUsersOnly:UseCG-1945asthehoststrainifyouplantoseparateDNA/baitandAD/libraryplasmidsbycycloheximidecounterselection.Alternatively,usepGBKT7toconstructyourbait.ThisDNA-BDvectorcontainsakanamycinresistancemarker;therefore,vectorscanbeseparatedinE.coliwithoutcycloheximidecounterselection.[詳細(xì)]

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• 酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)步驟和技巧分析

  LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD（202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標(biāo)蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1的調(diào)控，選擇與報(bào)告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)（EcoRI與XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（來自于E.coli的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個(gè)報(bào)告基因Leu，它與LacZ報(bào)告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動(dòng)子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時(shí)具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測(cè)蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫(kù)，則可用X從該文庫(kù)中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫(kù)2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4.對(duì)照質(zhì)粒：質(zhì)粒用途pLexA-53，pB42AD-T陽(yáng)性對(duì)照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕陽(yáng)性對(duì)照pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽(yáng)性檢測(cè)質(zhì)粒5.引物：pLexA測(cè)序引物及pB42AD測(cè)序引物。三、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程1.將報(bào)告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.同時(shí)構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫(kù)，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。3.構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。4.將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48（p8op-LacZ）細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測(cè)此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報(bào)告基因的活性，以及對(duì)酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長(zhǎng)情況說明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His，-Ura藍(lán)陽(yáng)性對(duì)照pLexASD/-His，-Ura白陰性對(duì)照PlexA-XSD/-His，-Ura白沒有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura藍(lán)具有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌落不能生長(zhǎng)酵母細(xì)胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號(hào)作用。b能夠自動(dòng)激活報(bào)告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報(bào)告基因整合入基因組，減少4-2.如果pLexA-X雖然不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，但對(duì)酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母。5.如果pLexA-X既不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型對(duì)照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍(lán)對(duì)照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍(lán)+pB42AD-T實(shí)驗(yàn)pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測(cè)+pB42AD-文庫(kù)5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達(dá)到Zda拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無表達(dá)。b5-2.上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽(yáng)性。白色克隆為假陽(yáng)性，說明Leu雖有表達(dá)，但5-3.同時(shí)用LacZ、Leu兩個(gè)報(bào)告基因的目的，是為了盡可能消除實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個(gè)報(bào)告基因的啟動(dòng)子不同，出現(xiàn)上述假陽(yáng)性的幾率就大大減少了。5-4.將藍(lán)色陽(yáng)性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫(kù)質(zhì)粒。6.陽(yáng)性克隆的篩選6-1.隨機(jī)選取50個(gè)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫(kù)質(zhì)粒。6-2.如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個(gè)陽(yáng)性克隆來分析。Z后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測(cè)是否仍為陽(yáng)性克隆。7.用質(zhì)粒自然分選法（NaturalSegregation）篩除只含有AD-文庫(kù)雜合子的克隆7-1.將初步得到的陽(yáng)性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機(jī)丟失。C孵育2-3天。°7-2.將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.再挑取生長(zhǎng)的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫(kù)雜合子的重組子。7-4.將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗(yàn)證AD-文庫(kù)能否直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，棄去陽(yáng)性克隆，保留陰性克隆。8.酵母雜合試驗(yàn)（YeastMating）確定真陽(yáng)性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對(duì)應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)?；蛭膸?kù)DNA，通過雜合實(shí)驗(yàn)確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫(kù)確實(shí)具有相互作用的真陽(yáng)性克隆。質(zhì)粒1（inYM4271）質(zhì)粒2（inEGY48）LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生長(zhǎng)pLexA-靶DNApB42AD白不能生長(zhǎng)pLexApB42AD-文庫(kù)白不能生長(zhǎng)pLexA-靶DNApB42AD-文庫(kù)藍(lán)真陽(yáng)性pLexA-LampB42AD-文庫(kù)白不能生長(zhǎng)9.陽(yáng)性克隆的進(jìn)一步篩選和確證9-1.擴(kuò)增初步確定的陽(yáng)性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2.將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容;同時(shí)利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。9-3.用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫(kù)DNA一一對(duì)應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報(bào)告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對(duì)照，說明報(bào)告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報(bào)告基因的表達(dá)。9-4.擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫(kù)DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。10.對(duì)雙雜交系統(tǒng)陽(yáng)性結(jié)果的進(jìn)一步研究10-1.用不同的雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證10-1-1.將載體pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實(shí)驗(yàn)。10-1-2.選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.將文庫(kù)質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報(bào)告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。b10-1-4.去除或突變特定結(jié)合位點(diǎn)，定量檢測(cè)10-2.用試劑盒提供的引物測(cè)定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.用其它的檢測(cè)方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4.進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫(kù)的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。lml加入90m3.取稀釋菌液各1090mm）;37℃倒置培養(yǎng)過夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（4.確定待擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×108（1:106稀釋）或克隆數(shù)×1010（1:108稀釋）。5.按照>150mm），共100塊;37℃倒置培養(yǎng)過夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板（6.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細(xì)菌;用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.0gB.bacto-YeastExtract5.0gC.NaCl10.0gD.ddH2O→1000ml*LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂（Agar）LB培養(yǎng)基。**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的純化1.質(zhì)粒DNA提取緩沖液名稱緩沖液配方g/mlRNasemP1懸浮緩沖液50mMTris-HCl（pH8.0）;10mMEDTA;100AP2裂解緩沖液200mMNaOH;1%SDSP3中和緩沖液3.0MKac（pH5.5）QBT平衡緩沖液750mMNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇;0.15%TritonX-100QC洗滌緩沖液1.0MNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇QF洗脫緩沖液1.25MNaCl;50mMTris-HCl（pH8.5）;15%異丙醇2.培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3.加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.加入4℃預(yù)冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置混勻4-6次）。5.將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4℃，保留上清。6.上清再離心12000xg×15min，4℃，留上清。7.將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8.以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9.以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，用2.5倍體積無水乙醇;1/10體積3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃靜置過夜。13.離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺(tái)風(fēng)干。l），保存于-20℃。mg/管（用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約40m14.干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞1.將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml3.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。4.準(zhǔn)備下列試劑2×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/120ml15mA.1×TE/LiAc0.15ml15l/ml960ml120mB.PEG/LiAc1.20ml120lml//900mC.1×TE1.00ml1005.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。lmg）3-5mA.pLexA-X（0.1B.10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m6.每管加入100lm7.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）20.0mlD.20×Leu10.0mlE.20×Trp10.0mlF.Agar4.00gG.ddH2O90-100mm）f→200.0ml鋪8-10塊平板（附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale轉(zhuǎn)化反應(yīng)2011（1）SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌100ml100ml300ml（2）YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌300mla300mla1000mla（3）TE或ddH2O洗滌酵母細(xì)胞15mlc25-50mlb500mla（4）準(zhǔn)備A.1×TE/LiAc緩沖液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc緩沖液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1×TE緩沖液6.0mlc10.0mlc10.0mlc（5）分裝A.DNA-BDvectorgd×20/0.2-1.0mgcm0.1gd0.1-0.5mgmg×2010-50mB.ADvector0.1C.l2.0mlml×20200mSpermDNA（10mg/ml）101×TE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞1.5mlc1.0mlc8.0mlbl×201.0ml8.0mlm酵母感受態(tài)細(xì)胞100（7）PEG/LiAc緩沖液0.6ml×206.0ml60.0mll7.0mlml×20700mDMSO70（9）室溫離心后棄上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min（10）1×TE重懸感受態(tài)細(xì)胞0.3ml×206.0ml10.0ml150mm×50f150mm×30f90mm×20f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板注:*即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”**在不同容積的無菌離心管中進(jìn)行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文庫(kù)cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞1.以生長(zhǎng)于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×Leu5.0mlE.20×Trp5.0mlF.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑1×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/800ml100mA.1×TE/LiAc1.0ml100l4.8ml/ml600mB.PEG/LiAc6.0ml600C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份，振蕩混勻。lmg）40mA.pB42AD-Library（50-100B.10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）200*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.加入6.0mlPEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。10.以6.0ml100mm，每稀釋度各×2），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取10150mm×30），30℃倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m11.按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）200.0mlD.20×Leu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm）f→2000.0ml鋪30塊平板（12.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）緩沖液，將菌落刮下。13.離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油;100mMMgSO4;25mMTris-HCl（pH8.0）A.甘油65.00mlB.MgSO47H2O2.465gC.2.0MTris-HCl（pH8.0）1.25mlD.ddH2O→100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的篩選1.經(jīng)過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫(kù)DNA及報(bào)告基因的酵母感受態(tài)細(xì)胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m2.取上述稀釋菌液各1003.確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×105（1:104稀釋）、克隆數(shù)×107（1:106稀釋）或克隆數(shù)×109（1:108稀釋）。4.按照以前實(shí)驗(yàn)確定的文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。5.挑取顯藍(lán)色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15minA.Na2HPO412H2O9.30gB.NaH2PO42H2O3.90gC.ddH2O→100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.挑取經(jīng)過酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Ura5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl（pH8.0）;1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.EDTANa22H2O0.04gF.1.0MHCl調(diào)pH8.0G.ddH2O→100.0ml4.加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min，室溫復(fù)融;再充分振蕩5min。A.經(jīng)酸處理的玻璃珠（Sigma）0.20gB.苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）0.2ml5.室溫離心12000xg×10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60min。A.3MNaAc（1/10lmV）20lmB.無水乙醇（2.5V）5006.離心12500xg×10min，4℃，棄上清;70%乙醇洗滌沉淀，于37℃烘箱或超凈臺(tái)干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于l無菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0WF，200m2.將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化（1.8kV，25。3.迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（16-22hr）。5.按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽(yáng)性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗(yàn)證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.葡萄糖1.2gB.Agar6.0gC.5×M9緩沖液60mlD.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）30mlE.20×His15mlF.20×Leu15mlG.20×Ura15mlH.ddH2O165ml冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板I.1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ.100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）f鋪10-15塊平板（大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電轉(zhuǎn)化）1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的E.coliKC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。2.將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.00gB.bacto-YeastExtract2.50gC.NaCl0.25gD.KCl0.09gE.MgCl26H2O1.02gF.ddH2O→500.0ml3.將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;以5ml預(yù)冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌;再加入500ml預(yù)冷的無菌ddH2O洗滌細(xì)菌。5.重復(fù)上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6.用40-50ml預(yù)冷的無菌10%甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中;離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;重復(fù)此步驟1次。7.以等體積（約1.5-2.0ml）預(yù)冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉(zhuǎn)化反應(yīng)），保存于-80℃?zhèn)溆?。酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的確證1.以含有報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑20×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlml150mA.1×TE/LiAc1.5ml150B.PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.pLexAlmg）3-5morpLexA-X（0.1lmg）3-5mB.pB42AD-Y（0.1C.10mg/mlSpermlmDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m7.每管加入100lm8.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm9.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。10.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen3.35gB.葡萄糖10.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）50.0mlD.20×Leu25.0mlE.Agar10.00gF.ddH2O→500.0ml90-100mm）f鋪20-25塊平板（11.挑取上述固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空載pLexA（-）單菌落，分別接種SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（12.選擇含有pLexA-X顯藍(lán)色，而相應(yīng)的不含有插入DNA的空載pLexA顯白色的克隆，擴(kuò)增其在E.coliKC8中的甘油菌，按常規(guī)抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列分析。10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）為不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。（1）L-IsoleucineL-異亮氨酸300mg（2）L-ValineL-纈氨酸1500mg（3）Adenine腺嘌呤200mg（4）L-ArginineHClL-精氨酸200mg（5）L-LysineHClL-賴氨酸鹽酸鹽300mgL-MethionineL-甲硫氨酸200mg（7）L-PhenylalanineL-苯丙氨酸500mgL-ThreonineL-蘇氨酸2000mg（9）L-TyrosineL-酪氨酸300mg20×氨基酸儲(chǔ)存液每100ml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4℃。20×HisL-HistidineL-組氨酸40mg20×TrpL-TryptophanL-色氨酸40mg20×LeuL-LeucineL-白氨酸200mg20×UraUracil尿嘧啶40mg酵母轉(zhuǎn)化緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制10×TE100mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O80ml;鹽酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容10×LiAc100mlLiAc2H2O10.20g;ddH2O50ml，冰醋酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容50%PEG100mlPEG335050.0g;ddH2O定容其它緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制TE1000mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH;ddH2O定容STE1000mlNaCl5.84g;Tris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH8.0;ddH2O定容[詳細(xì)]

  2018-10-12 10:00

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  pTK-hyg型號(hào)載體名稱出品公司載體用途VSC0467pTK-hygClontech四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)DescriptionpTK-Hygisaselectionvectorthatconfershygromycinresistanceinmammaliancellsfortheselectionofstablytransformedcells.pTK-Hygisespeciallyusefulforselectionofdouble-stablecelllinesusingtheTet-OnorTet-OffGeneExpressionSystemsbecausetheabsenceofanenhancerelementonpTK-HygpreventstheunwantedactivationofpTRE-andpBI-derivedplasmidsuponcointegrationintothehostcell'sgenome.UsepTK-Hygcanbecotransfectedintothehostcelllinewithanexpressionplasmidthatcontainsageneofinterestusinganystandardtransfectiontechnique.Mostmammaliancelllinesrequire200g/mlofHygromycintoselectforstablytransformedcells.LocationofFeaturesHSVTKpolyAsignals:14731478&14861491（complementary）Hygr（hygromycinresistancegene）:15372574（complementary）PHSVTK（HSVTKpromoter）:25882835（complementary）pUCoriginofreplication:3152379mpr（ampicillinresistancegene;beta-lactamase）:39434803PropagationinE.coliSuitablehoststrains:DH5aandothergeneralpurposestrains.Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin（50g/ml）onE.colihosts.E.colireplicationorigin:pUC質(zhì)粒圖譜:[詳細(xì)]

  2018-09-29 10:03

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  酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用[詳細(xì)]

  2009-03-28 00:00

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  畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)說明書YoucanputthepowerofP.pastorisintoyourlaboratorywithacompletePichiaExpressionKitorwithindividualPichiaexpressionvectors.ThreePichiaExpressionKitsareavailable,eachofwhichincludesvectors,P.pastorisstrains,reagentsfortransformation,sequencingprimers,media,andacomprehensivemanual（Table3）.Inaddition,thepPICZ,pGAPZ,andpPIC6vectorsareavailableseparately（seeinsertfororderinginformation）.ChoosethekitorvectorthatbestmeetsyourresearchneedsandtakeadvantageoftheprovenstrengthofP.pastoris.Table3Pichiaexpressionkitcomponents.EasySelectPichiaExpressionKitMulti-CopyPichiaExpressionKitOriginalPichiaExpressionKitVectorspPICZA,B,C（20geach）pPICZαA,B,C（20geach）pPIC9K（20g）pPIC3.5K（20g）pAO815（20g）pPIC9（10g）pPIC3.5（10g）pHIL-D2（10g）pHIL-S1（10g）StrainsX-33（Mut+,His+）GS115（Mut+）KM71（MutS）GS115/pPICZ/lacZ（control）GS115（Mut+）KM71（MutS）GS115/β-gal（control）GS115/albumin（control）GS115（Mut+）KM71（MutS）GS115/β-gal（control）GS115/albumin（control）TransformationreagentsPichiaEasyCompKit（120transformations）SpheroplastModule（50transformations）SpheroplastModule（50transformations）SequencingprimersOX13AOX1α-factorOX13AOX1α-factorOX13AOX1α-factorMediaandsupplementsYPbasemedium（2pouches）*YPbaseagar（2pouches）*YeastNitrogenBase（1pouch）Zeocin（250mg）YPbasemedium（2pouches）*YPbaseagar（2pouches）*YeastNitrogenBase（1pouch）YPbasemedium（2pouches）*YPbaseagar（2pouches）*YeastNitrogenBase（1pouch）上海起福生物科技有限公司聯(lián)系人：楊建輝400電話：4006551678辦公電話：021-50724187傳真：021-50724961*8006手機(jī)：15921799099企業(yè)QQ:4006551678網(wǎng)址:http://www.qfbio.com/地址：上海市浦東新區(qū)繡川路561號(hào)1102室[詳細(xì)]

  2018-09-29 10:02

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  核糖核酸（酵母）[詳細(xì)]

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  酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書[詳細(xì)]

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• 酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒使用說明書

  酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。實(shí)驗(yàn)原理酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中酵母過氧化氫酶（CAT）水平。用純化的酵母過氧化氫酶（CAT）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入過氧化氫酶（CAT），再與HRP標(biāo)記的過氧化氫酶（CAT）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的過氧化氫酶（CAT）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中酵母過氧化氫酶（CAT）濃度。酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（16U/L）0.5ml×1瓶3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3YZ辣根過氧化物酶的（HRP）活性。酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。8U/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液4U/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2U/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1U/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液0.5U/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品Z終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒注意事項(xiàng)1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，**做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔**孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)Z后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物請(qǐng)避光保存。7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。酵母過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒保存條件及有效期1．試劑盒保存：2-8℃。2．有效期：6個(gè)月[詳細(xì)]

  2018-11-23 10:00

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  2018-09-30 10:00

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