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研究發(fā)現(xiàn)識(shí)別miRNA靶標(biāo)新方法
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本文由 上海士鋒生物科技有限公司 整理匯編
2016-07-27 00:00 628閱讀次數(shù)
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研究發(fā)現(xiàn)識(shí)別miRNA靶標(biāo)新方法
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干細(xì)胞培養(yǎng)新方法
- 現(xiàn)有人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化,都離不開動(dòng)物源培養(yǎng)基,比如從實(shí)驗(yàn)鼠身上分離出來的結(jié)締組織細(xì)胞和牛胚胎血清等。選擇Zyou化的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于ES的研究及臨床應(yīng)用是至關(guān)重要的。胚胎干細(xì)胞(ES)是一種永生化細(xì)胞因子,在適宜培養(yǎng)條件下具有的自我更新能力并維持未分化狀態(tài)、高端粒酶活性、正常核型、胚胎表面標(biāo)志及多潛能轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),如SSEA、OCT-4、Nanog等。ES被認(rèn)為可以提供一種理想的生物學(xué)平臺(tái),用于多方面的科學(xué)研究與臨床應(yīng)用,如藥物篩選平臺(tái)的建立、細(xì)胞發(fā)育與分化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究、基因靶向敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建、組織工程種子細(xì)胞及基因ZL載體的建立、細(xì)胞ZL及再生醫(yī)學(xué)等。以往研究表明,基質(zhì)表面的化學(xué)和物理特性,比如粗糙度、硬度、對(duì)水的親和力等對(duì)干細(xì)胞生長有影響。研究人員創(chuàng)造了500種特性不同的聚合物并在上面培養(yǎng)干細(xì)胞,分析每個(gè)聚合物上面細(xì)胞的生長狀況。他們發(fā)現(xiàn),基質(zhì)表面疏水性對(duì)細(xì)胞生長有個(gè)**范圍,而表面糙度和硬度則沒有太多影響。此外,他們調(diào)整**聚合物的組成為:高比例的丙烯酸酯,外面包裹玻連蛋白。多能干細(xì)胞培養(yǎng)目前存在一些問題,比如如何培養(yǎng)足夠量的多功能干細(xì)胞,如何能避免培養(yǎng)人類干細(xì)胞的材料發(fā)生免疫反應(yīng)。在培養(yǎng)人類干細(xì)胞的材料方面,近期來自麻省理工的研究人員發(fā)明了一種合成性基質(zhì),這種基質(zhì)沒有外來動(dòng)物材料,能夠使干細(xì)胞至少三個(gè)月保持活性并自我繁殖。而且,該合成性基質(zhì)S次使得單細(xì)胞能夠形成細(xì)胞集落。這一成果公布在NatureMaterials雜志上。應(yīng)用這種新的培養(yǎng)基質(zhì),研究人員成功實(shí)現(xiàn)了人類胚胎干細(xì)胞持續(xù)三個(gè)月的生長和分裂,并獲得了大量的細(xì)胞。他們將進(jìn)一步研究,爭(zhēng)取將這種培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)用到其它類細(xì)胞另外針對(duì)如何能夠培養(yǎng)足夠量的多功能干細(xì)胞呢?來自俄亥俄州立大學(xué)研究人員研制出一種大批量生產(chǎn)胚胎干細(xì)胞(mass-producingembryonicstemcells)的新方法。用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法生產(chǎn)干細(xì)胞不僅價(jià)格高,Z主要的是不能滿足日益增長的對(duì)人類胚胎干細(xì)胞的需要。研究人員在一種生物反應(yīng)器(bioreactor)中培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量在15天內(nèi)擴(kuò)增了193倍,實(shí)驗(yàn)尾期的細(xì)胞密度反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)是用實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)方法得到的10-100倍,也就意味著多出數(shù)億的干細(xì)胞。并且檢測(cè)結(jié)果顯示,bioreactor中的干細(xì)胞未分化程度更高,壽命更長。這種類型的大批量生產(chǎn)因?yàn)樾枰俚脑O(shè)備和管理,因此干細(xì)胞生產(chǎn)成本降低了80%。實(shí)驗(yàn)過程中,研究人員分別在flask中(傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法)和bioreactor中的標(biāo)準(zhǔn)高聚物螺紋上培養(yǎng)小鼠干細(xì)胞。用flask和用bioreactor培養(yǎng)干細(xì)胞的不同之處在于:細(xì)胞在bioreactor中能夠向三維空間生長,而在flask的底部平面上只能向二維平面上生長。bioreactor培養(yǎng)的細(xì)胞相對(duì)于flask培養(yǎng)的細(xì)胞壽命長,因?yàn)榧?xì)胞有更多的空間。研究人員使用的bioreactor實(shí)際上是一種組織生長設(shè)備(tissue-growingdevice),能夠用于培養(yǎng)成人干細(xì)胞,并且能夠使研究人員對(duì)培養(yǎng)過程中的每個(gè)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行緊密跟蹤。新型bioreactor有兩個(gè)格室(chamber),一個(gè)格室內(nèi)包含可以支持干細(xì)胞生長的高聚物螺紋,一個(gè)格室內(nèi)含有液態(tài)培養(yǎng)基。這種液態(tài)培養(yǎng)基能夠向干細(xì)胞傳遞炎癥因子,維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)。研究人員以兩種蛋白為指標(biāo)檢測(cè)flask和bioreactor得到的細(xì)胞(蛋白的出現(xiàn)標(biāo)志干細(xì)胞還沒有分化)。檢測(cè)結(jié)果顯示,用bioreactor培養(yǎng)的細(xì)胞94%呈陽性,用flask培養(yǎng)的細(xì)胞85%呈陽性。除此之外,以色列耶路撒冷哈達(dá)薩大學(xué)的研究人員開發(fā)出一種新的干細(xì)胞培養(yǎng)基,能讓干細(xì)胞在更長時(shí)間內(nèi)不分化。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《NatureBiotechnology》上。為了保持hESC存活且具有多能性,研究人員通常在滋養(yǎng)層細(xì)胞(也就是一層小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)上培養(yǎng),或者在微載體上成簇培養(yǎng)。但是在這些基質(zhì)上培養(yǎng)干細(xì)胞是相當(dāng)昂貴的,而且培養(yǎng)物不能在很長時(shí)間內(nèi)保持未分化狀態(tài),盡管所有必需的生長因子都存在。為了驗(yàn)證他們的理論,研究小組定制了培養(yǎng)基。他們?cè)贜eurobasal培養(yǎng)基中加入了血清替代物,還加入了干細(xì)胞生長所需的蛋白,包括細(xì)胞外基質(zhì)組分、神經(jīng)營養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長因子2和活化素A。研究人員在常規(guī)的無血清培養(yǎng)基和定制培養(yǎng)基中培養(yǎng)了hESC。三個(gè)星期之后,定制培養(yǎng)基中存在更多的未分化hESC細(xì)胞。研究人員分析hESC簇分化成神經(jīng)細(xì)胞,他們一直在使用Invitrogen的Neurobasal培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基能夠在無滋養(yǎng)層的條件下長時(shí)間維持神經(jīng)細(xì)胞的生長和正常表型。在研究過程中,研究人員注意到并非所有細(xì)胞都分化了。他們懷疑是培養(yǎng)基的選擇導(dǎo)致了這種現(xiàn)象,于是他們開始集中精力研究培養(yǎng)基如何促進(jìn)干細(xì)胞生長并YZ分化。使用這種新的培養(yǎng)基,研究小組檢驗(yàn)了三種不同的hESC系。他們利用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)在7周和20周后分析了培養(yǎng)物,發(fā)現(xiàn)90%的細(xì)胞仍維持多能性。這項(xiàng)突破為在計(jì)算機(jī)化的自動(dòng)系統(tǒng)中大規(guī)模擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞創(chuàng)造了可能性。此外,通過改變培養(yǎng)條件,還可能進(jìn)一步指導(dǎo)干細(xì)胞長成特定的細(xì)胞類型,用于研究或病人的移植。[詳細(xì)]
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2018-10-03 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
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離子通道及其在呼吸系統(tǒng)疾病靶標(biāo)中的作用
- 2019年底出現(xiàn)SARS-CoV-2(新型冠狀病毒)大流行,再加上持續(xù)的季節(jié)性和大流行性流感病毒的感染,已經(jīng)給范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生和衛(wèi)生系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的影響。為了阻止這種流行病并挽救生命,迫切需要有效對(duì)抗這些病毒的抗病和疫苗。
許多病毒孔蛋白和離子通道參與了病毒感染和呼吸系統(tǒng)疾病。[詳細(xì)]
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2020-06-26 21:24
應(yīng)用文章
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農(nóng)藥三唑酮分子印跡聚合物的識(shí)別特性研究
- 農(nóng)藥三唑酮分子印跡聚合物的識(shí)別特性研究[詳細(xì)]
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2024-09-20 15:34
標(biāo)準(zhǔn)
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ZG醫(yī)學(xué)科學(xué)院JBC解析抑癌miRNA
- ZG醫(yī)學(xué)科學(xué)院JBC解析抑癌miRNA[詳細(xì)]
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2013-10-12 00:00
課件
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miRNA定量及均一化cDNA文庫技術(shù)
- 進(jìn)行一次逆轉(zhuǎn)錄即可實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)miRNA的測(cè)定?沒錯(cuò),采用加尾法,一次逆轉(zhuǎn)錄就可以得到全部miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。我們知道,真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,這樣Oligo-dT(逆轉(zhuǎn)錄引物)就很容易結(jié)合到mRNA上來合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴,怎么辦呢?在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中加入poly-A聚合酶,先給它們加上一串poly-A尾巴,然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉(zhuǎn)錄酶來合成cDNA。這樣一來,一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA,接下來想用來檢測(cè)什么都可以!您只需要提供1μg合格的totalRNA,就可以對(duì)所有感興趣的miRNA進(jìn)行檢測(cè)。這既可避免莖環(huán)法(各目標(biāo)miRNA單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄)帶來的逆轉(zhuǎn)錄效率、加樣誤差等方面的影響,還可節(jié)約多條特異逆轉(zhuǎn)錄引物和多次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的花費(fèi),可謂一舉兩得,何樂而不為?均一化cDNA文庫基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異常常給文庫篩選和分析帶來障礙,采用均一化文庫技術(shù)可有效克服這一問題?!【换痗DNA文庫具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn):**,在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間,可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二,增加克隆低豐度mRNA的機(jī)會(huì),適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三,與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫作雜交,可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構(gòu)建,忽略了mRNA豐度的影響。第四,可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交,作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序?,F(xiàn)在,在構(gòu)建均一化的cDNA文庫中至少有2種主要的觀點(diǎn):一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理,高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的速度快,而低豐度的cDNA復(fù)性要很長時(shí)間,從而可以通過控制復(fù)性時(shí)間來降低豐度;另一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì),通過cDNA與基因組DNA飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度。**種方法的掌握對(duì)技術(shù)的要求比較高,對(duì)多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到Z適條件;而后一種方法易于掌握,但有研究者根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理也提出了其不利因素,即采用基因組DNA飽和雜交的方法會(huì)因?yàn)榈涂截惖谋磉_(dá)基因拷貝數(shù)少而無法被雜交上。DSN(duplexspecificenzyme)是Z近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶(Shagin.,2002)。該酶能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNARNA雜交體中的DNA,對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒有作用。同目前常用的均一化技術(shù)相比,基于DSN的均一化技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)單,所需要的起始材料也比較少,具有較好的應(yīng)用前景。上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開展miRNA定量檢測(cè)服務(wù)已經(jīng)近三年時(shí)間,服務(wù)項(xiàng)目幾百個(gè)。擁有自己的miRNA引物庫(人類),對(duì)其他物種可以自行設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)樣品范圍廣,包括:細(xì)胞、組織、血液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等,操作規(guī)范,時(shí)間可控,為廣大研究工作者提供了良好的便利。同時(shí),其作為國內(nèi)cDNA文庫構(gòu)建的主流服務(wù)供應(yīng)商,在長期穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)服務(wù)過程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),已經(jīng)成功構(gòu)建包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌等幾十個(gè)物種的cDNA文庫。他們基于雙鏈特異性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease,DSN)的先進(jìn)cDNA文庫均一化技術(shù),能減低高豐度表達(dá)基因100倍以上,有效富集低豐度表達(dá)基因,從而降低冗余率。[詳細(xì)]
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2024-09-29 02:39
產(chǎn)品樣冊(cè)
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預(yù)測(cè)細(xì)胞毒性新方法
- 在體外快速的、GX的、可靠的早期預(yù)測(cè)毒性對(duì)藥物研發(fā)、減少藥物臨床試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。利用現(xiàn)代生命科學(xué)的新進(jìn)展,建立和應(yīng)用新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)和毒理學(xué)機(jī)制研究的新技術(shù)、新方法和新模型成為當(dāng)今國際新藥研發(fā)的新趨勢(shì)。[詳細(xì)]
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2021-02-19 13:57
應(yīng)用文章
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硬度深度分布測(cè)試新方法
- 硬度深度分布測(cè)試新方法[詳細(xì)]
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2024-09-12 18:29
課件
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硅樹脂涂層分析新方法
- 硅樹脂涂層分析新方法[詳細(xì)]
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2024-09-27 23:49
實(shí)驗(yàn)操作
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關(guān)于成像光譜技術(shù)對(duì)蘋果斑點(diǎn)及損傷快速識(shí)別研究
- 取蘋果黑斑區(qū)域、損傷區(qū)域、正常區(qū)域和背景各3個(gè)不同位置周邊50個(gè)像元,分別獲取這3個(gè)不同位置50個(gè)像元的光譜反射率,并求取這50個(gè)像元的反射率均值,如圖所示,其中,蘋果沒有損傷區(qū)域的光譜反射率在500-680nm范圍內(nèi)高于損傷區(qū)域及黑斑區(qū)域的光譜反射率;在550-700nm范圍內(nèi),蘋果黑斑區(qū)域的光譜反射率較低;在580-700nm范圍內(nèi),蘋果黑斑區(qū)域、損傷區(qū)域、正常區(qū)域的光譜存在較為顯著的波峰波谷,而背景無顯著特征。在550-680nm范圍內(nèi),損傷區(qū)域的光譜反射率鑒于蘋果黑斑區(qū)域和正常區(qū)域之間,因此可以嘗試通過構(gòu)建植被指數(shù)和閾值分割方法快速識(shí)別出蘋果黑斑區(qū)域和損傷區(qū)域。[詳細(xì)]
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2018-09-12 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
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