資料庫(kù)
miRNA定量及均一化cDNA文庫(kù)技術(shù)
-
本文由 研域(上海)化學(xué)試劑有限公司 整理匯編
2024-09-29 02:39 1390閱讀次數(shù)
文檔僅可預(yù)覽首頁(yè)內(nèi)容,請(qǐng)下載后查看全文信息!
-
立即下載
進(jìn)行一次逆轉(zhuǎn)錄即可實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)miRNA的測(cè)定?沒(méi)錯(cuò),采用加尾法,一次逆轉(zhuǎn)錄就可以得到全部miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。我們知道,真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,這樣Oligo-dT(逆轉(zhuǎn)錄引物)就很容易結(jié)合到mRNA上來(lái)合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴,怎么辦呢?在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中加入poly-A聚合酶,先給它們加上一串poly-A尾巴,然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)合成cDNA。這樣一來(lái),一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA,接下來(lái)想用來(lái)檢測(cè)什么都可以!您只需要提供1μg合格的totalRNA,就可以對(duì)所有感興趣的miRNA進(jìn)行檢測(cè)。這既可避免莖環(huán)法(各目標(biāo)miRNA單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄)帶來(lái)的逆轉(zhuǎn)錄效率、加樣誤差等方面的影響,還可節(jié)約多條特異逆轉(zhuǎn)錄引物和多次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的花費(fèi),可謂一舉兩得,何樂(lè)而不為?均一化cDNA文庫(kù)基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異常常給文庫(kù)篩選和分析帶來(lái)障礙,采用均一化文庫(kù)技術(shù)可有效克服這一問(wèn)題。 均一化cDNA文庫(kù)具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn):**,在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間,可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二,增加克隆低豐度mRNA的機(jī)會(huì),適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三,與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫(kù)作雜交,可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫(kù)構(gòu)建,忽略了mRNA豐度的影響。第四,可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交,作為優(yōu)化的文庫(kù)系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序?,F(xiàn)在,在構(gòu)建均一化的cDNA文庫(kù)中至少有2種主要的觀點(diǎn):一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理,高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的速度快,而低豐度的cDNA復(fù)性要很長(zhǎng)時(shí)間,從而可以通過(guò)控制復(fù)性時(shí)間來(lái)降低豐度;另一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì),通過(guò)cDNA與基因組DNA飽和雜交而降低在文庫(kù)中高拷貝存在的cDNA的豐度。**種方法的掌握對(duì)技術(shù)的要求比較高,對(duì)多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到Z適條件;而后一種方法易于掌握,但有研究者根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理也提出了其不利因素,即采用基因組DNA飽和雜交的方法會(huì)因?yàn)榈涂截惖谋磉_(dá)基因拷貝數(shù)少而無(wú)法被雜交上。DSN(duplexspecificenzyme)是Z近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶(Shagin.,2002)。該酶能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNARNA雜交體中的DNA,對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒(méi)有作用。同目前常用的均一化技術(shù)相比,基于DSN的均一化技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)單,所需要的起始材料也比較少,具有較好的應(yīng)用前景。上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開(kāi)展miRNA定量檢測(cè)服務(wù)已經(jīng)近三年時(shí)間,服務(wù)項(xiàng)目幾百個(gè)。擁有自己的miRNA引物庫(kù)(人類(lèi)),對(duì)其他物種可以自行設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)樣品范圍廣,包括:細(xì)胞、組織、血液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等,操作規(guī)范,時(shí)間可控,為廣大研究工作者提供了良好的便利。同時(shí),其作為國(guó)內(nèi)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的主流服務(wù)供應(yīng)商,在長(zhǎng)期穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)服務(wù)過(guò)程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),已經(jīng)成功構(gòu)建包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌等幾十個(gè)物種的cDNA文庫(kù)。他們基于雙鏈特異性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease,DSN)的先進(jìn)cDNA文庫(kù)均一化技術(shù),能減低高豐度表達(dá)基因100倍以上,有效富集低豐度表達(dá)基因,從而降低冗余率。
登錄或新用戶(hù)注冊(cè)
請(qǐng)用手機(jī)微信掃描下方二維碼
快速登錄或注冊(cè)新賬號(hào)
微信掃碼,手機(jī)電腦聯(lián)動(dòng)
更多資料
-
miRNA定量及均一化cDNA文庫(kù)技術(shù)
- 進(jìn)行一次逆轉(zhuǎn)錄即可實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)miRNA的測(cè)定?沒(méi)錯(cuò),采用加尾法,一次逆轉(zhuǎn)錄就可以得到全部miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。我們知道,真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,這樣Oligo-dT(逆轉(zhuǎn)錄引物)就很容易結(jié)合到mRNA上來(lái)合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴,怎么辦呢?在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中加入poly-A聚合酶,先給它們加上一串poly-A尾巴,然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)合成cDNA。這樣一來(lái),一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA,接下來(lái)想用來(lái)檢測(cè)什么都可以!您只需要提供1μg合格的totalRNA,就可以對(duì)所有感興趣的miRNA進(jìn)行檢測(cè)。這既可避免莖環(huán)法(各目標(biāo)miRNA單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄)帶來(lái)的逆轉(zhuǎn)錄效率、加樣誤差等方面的影響,還可節(jié)約多條特異逆轉(zhuǎn)錄引物和多次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的花費(fèi),可謂一舉兩得,何樂(lè)而不為?均一化cDNA文庫(kù)基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異常常給文庫(kù)篩選和分析帶來(lái)障礙,采用均一化文庫(kù)技術(shù)可有效克服這一問(wèn)題。 均一化cDNA文庫(kù)具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn):**,在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間,可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二,增加克隆低豐度mRNA的機(jī)會(huì),適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三,與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫(kù)作雜交,可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫(kù)構(gòu)建,忽略了mRNA豐度的影響。第四,可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交,作為優(yōu)化的文庫(kù)系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序?,F(xiàn)在,在構(gòu)建均一化的cDNA文庫(kù)中至少有2種主要的觀點(diǎn):一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理,高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的速度快,而低豐度的cDNA復(fù)性要很長(zhǎng)時(shí)間,從而可以通過(guò)控制復(fù)性時(shí)間來(lái)降低豐度;另一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì),通過(guò)cDNA與基因組DNA飽和雜交而降低在文庫(kù)中高拷貝存在的cDNA的豐度。**種方法的掌握對(duì)技術(shù)的要求比較高,對(duì)多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到Z適條件;而后一種方法易于掌握,但有研究者根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理也提出了其不利因素,即采用基因組DNA飽和雜交的方法會(huì)因?yàn)榈涂截惖谋磉_(dá)基因拷貝數(shù)少而無(wú)法被雜交上。DSN(duplexspecificenzyme)是Z近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶(Shagin.,2002)。該酶能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNARNA雜交體中的DNA,對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒(méi)有作用。同目前常用的均一化技術(shù)相比,基于DSN的均一化技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)單,所需要的起始材料也比較少,具有較好的應(yīng)用前景。上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開(kāi)展miRNA定量檢測(cè)服務(wù)已經(jīng)近三年時(shí)間,服務(wù)項(xiàng)目幾百個(gè)。擁有自己的miRNA引物庫(kù)(人類(lèi)),對(duì)其他物種可以自行設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)樣品范圍廣,包括:細(xì)胞、組織、血液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等,操作規(guī)范,時(shí)間可控,為廣大研究工作者提供了良好的便利。同時(shí),其作為國(guó)內(nèi)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的主流服務(wù)供應(yīng)商,在長(zhǎng)期穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)服務(wù)過(guò)程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),已經(jīng)成功構(gòu)建包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌等幾十個(gè)物種的cDNA文庫(kù)。他們基于雙鏈特異性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease,DSN)的先進(jìn)cDNA文庫(kù)均一化技術(shù),能減低高豐度表達(dá)基因100倍以上,有效富集低豐度表達(dá)基因,從而降低冗余率。[詳細(xì)]
-
2024-09-29 02:39
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
miRNA研究新思路
- miRNA研究新思路[詳細(xì)]
-
2018-09-04 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
胎盤(pán)組織cDNA實(shí)驗(yàn)
- 本產(chǎn)品是以人胎盤(pán)組織RNA為模板,oligodt以及Random為引物,用上海研謹(jǐn)生物的高靈敏度的逆轉(zhuǎn)錄酶(YJ0740)反轉(zhuǎn)錄得到的PCR即用型cDNA,可用于PCR實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。[詳細(xì)]
-
2024-10-02 18:23
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
人胎盤(pán)cDNA操作步驟
- 本產(chǎn)品是以人胎盤(pán)組織RNA為模板,oligodt以及Random為引物,用上海研謹(jǐn)生物的高靈敏度的逆轉(zhuǎn)錄酶(YJ0740)反轉(zhuǎn)錄得到的PCR即用型cDNA,可用于PCR實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。[詳細(xì)]
-
2018-09-04 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
應(yīng)用原子吸收光譜分析技術(shù)之原子化技術(shù)
- 應(yīng)用原子吸收光譜分析技術(shù)之原子化技術(shù)[詳細(xì)]
-
2024-09-30 02:34
標(biāo)準(zhǔn)
-
研究發(fā)現(xiàn)識(shí)別miRNA靶標(biāo)新方法
- 研究發(fā)現(xiàn)識(shí)別miRNA靶標(biāo)新方法[詳細(xì)]
-
2016-07-27 00:00
專(zhuān)利
-
Eppendorf 工作站NGS文庫(kù)構(gòu)建方案
- 高質(zhì)量的下一代測(cè)序 (NGS) 文庫(kù)的制備是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,需要投入大量時(shí)間、經(jīng)費(fèi)和專(zhuān)業(yè)知識(shí)。珍貴樣品通常要處理多日(取決于所用試劑盒),直至準(zhǔn)備好文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。完整的方法由多個(gè)部分組成,每個(gè)都有特有的精度要求和數(shù)百個(gè)移液步驟。由于移液精度取決于用戶(hù),因此導(dǎo)致了不穩(wěn)定性,這對(duì)重復(fù)性產(chǎn)生了負(fù)面影響。
Eppendorf epMotion? 自動(dòng)移液工作站可以用極少的用戶(hù)干預(yù)和設(shè)定時(shí)間來(lái)簡(jiǎn)化這個(gè)費(fèi)力的過(guò)程,即使是對(duì)于樣本數(shù)量較少的操作也可使用。為了盡可能減少編程并讓您快速啟動(dòng)和運(yùn)行,Eppendorf 提供了經(jīng)過(guò)預(yù)先優(yōu)化和試劑廠(chǎng)家認(rèn)可的 NGS 試劑盒方法,這將獲得可重復(fù)的優(yōu)質(zhì)的二代測(cè)序文庫(kù)。[詳細(xì)]
-
2023-09-15 15:01
應(yīng)用文章
-
PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410
- PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410[詳細(xì)]
-
2024-09-28 01:11
操作手冊(cè)
-
人cDNA**鏈合成elisa試劑盒使用方法
- 本試劑盒僅供研究使用。檢測(cè)范圍:96T20pg/ml-480pg/ml使用目的:本試劑盒用于測(cè)定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中cDNA**鏈合成(M-MLV)含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人cDNA**鏈合成(M-MLV)水平。用純化的人cDNA**鏈合成(M-MLV)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入cDNA**鏈合成(M-MLV),再與HRP標(biāo)記的cDNA**鏈合成(M-MLV)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的cDNA**鏈合成(M-MLV)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中人cDNA**鏈合成(M-MLV)濃度。[詳細(xì)]
-
2018-10-01 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建必備實(shí)驗(yàn)技巧
- 基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建必備實(shí)驗(yàn)技巧基因組DNA文庫(kù)用途十分廣泛,如用于人類(lèi)及動(dòng)植物基因組學(xué)研究,基因表達(dá)調(diào)控研究,分析、分離特定的基因片段等.通常情況下,基因組文庫(kù)構(gòu)建的基本流程可以歸為四大步驟:分離基因組DNA、對(duì)基因組DNA作相關(guān)的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞.一、分離基因組DNA(gDNA)毫無(wú)疑問(wèn),高質(zhì)量的基因組DNA對(duì)于基因組文庫(kù)構(gòu)建是至關(guān)重要的.需要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)選擇合適的基因組DNA分離方法,在分離過(guò)程中保證DNA不被過(guò)度剪切或降解,同時(shí)也要盡量保證DNA的純度.二、處理基因組DNA根據(jù)研究目的,研究者需要選擇合適的載體.不同的載體對(duì)基因組DNA的長(zhǎng)度有不同的要求,必須選擇合適長(zhǎng)度的基因組DNA來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù).比如,對(duì)于黏粒載體,合適的片段長(zhǎng)度大約為40kb;對(duì)于BAC載體,合適的片段長(zhǎng)度平均為120kb-300kb.構(gòu)建黏?;蚪MDNA文庫(kù),需要將基因組DNA用注射器抽打來(lái)隨機(jī)剪切DNA;接著用末端修復(fù)酶修復(fù)DNA,可以提高DNA連接入載體的效率;然后通過(guò)脈沖場(chǎng)電泳或者普通電泳來(lái)找到40kb左右的DNA片段,隨后使用膠回收試劑盒回收DNA.構(gòu)建BAC基因組DNA文庫(kù),需要將基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶(常用EcoRI、BamHI或者HindIII)來(lái)消化基因組DNA,然后通過(guò)脈沖場(chǎng)電泳找到合適長(zhǎng)度的DNA片段(比如100kb-150kb),隨后透析回收DNA.需要注意:(1)電泳時(shí),要選用合適的DNALadder,以保證電泳后可以準(zhǔn)確定位所需分子量的DNA.(2)電泳以后,應(yīng)盡量縮短用紫外光照射目標(biāo)DNA的時(shí)間,否則會(huì)顯著降低克隆效率.(3)回收DNA的時(shí)候,應(yīng)該要避免過(guò)度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫(kù)質(zhì)量.三、載體的選擇目前,常用的基因組文庫(kù)載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體(P1人工染色體)、BAC載體(細(xì)菌人工染色體)和YAC載體(酵母人工染色體).選用何種載體可以參考如下幾個(gè)因素:1、目標(biāo)區(qū)域的大?。喝绻蚪M的目標(biāo)區(qū)域很?。ㄐ∮?0kb),那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體.利用現(xiàn)有的商品化的黏粒載體、GX率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株,可以方便的構(gòu)建黏粒載體文庫(kù).如果基因組的目標(biāo)區(qū)域比較大,那么P1、PAC或者BAC就比較合適了.P1操作比較困難,PAC相對(duì)簡(jiǎn)便.BAC載體也是很好的選擇,可以利用現(xiàn)有的成熟產(chǎn)品來(lái)構(gòu)建BAC文庫(kù),比如商業(yè)化的一系列BAC載體及配套試劑盒.如果目標(biāo)區(qū)域非常大(大于250kb),那么YAC載體就是了.不過(guò),應(yīng)用YAC載體來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù),操作非常繁瑣困難.表1各種載體的比較載體容量(kb)宿主導(dǎo)入細(xì)胞方式黏粒30-45大腸桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)P170-100大腸桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)PAC130-150大腸桿菌電轉(zhuǎn)BAC120-300大腸桿菌電轉(zhuǎn)YAC250-400酵母轉(zhuǎn)化2、篩選文庫(kù)的難易程度:黏粒載體一般使用傳統(tǒng)的濾膜影印雜交來(lái)篩選,但是這種方法對(duì)于構(gòu)建區(qū)域圖譜及疊連群來(lái)說(shuō)既費(fèi)力又浪費(fèi).大容量載體文庫(kù),如P1、PAC、BAC、YAC,以二維陣列保存,既可以用傳統(tǒng)的單拷貝的探針雜交法篩選,又可以用PCR進(jìn)行多克隆的群體篩選.而且,使用高容量載體構(gòu)建文庫(kù),可以減少染色體步查的步驟.3、載體拷貝數(shù)的考慮:當(dāng)把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時(shí),克隆DNA會(huì)發(fā)生重組,從而影響克隆序列的保真性和穩(wěn)定性;而單拷貝載體的低產(chǎn)量DNA是高通量分析的瓶頸.對(duì)這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系統(tǒng),CopyControlTM技術(shù)整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優(yōu)點(diǎn).單拷貝載體能提高插入片段的穩(wěn)定性,而且能在誘導(dǎo)劑的作用下,即時(shí)擴(kuò)增出高拷貝數(shù)的克隆而獲得高產(chǎn)量的DNA.四、將基因組DNA片段連接入載體使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體.許多商業(yè)化載體已經(jīng)經(jīng)過(guò)預(yù)處理,可以直接使用,無(wú)需內(nèi)切酶消化及脫磷酸化處理.選用連接快、效率高的連接酶,連接反應(yīng)體系以100μl為宜.注意:BAC載體連接完以后,需要將連接產(chǎn)物做脫鹽處理,除去連接反應(yīng)緩沖液里的鹽分.五、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞如果構(gòu)建黏粒文庫(kù),需要用包裝蛋白來(lái)包裝上述的連接反應(yīng)產(chǎn)物,測(cè)定包裝好的黏??寺〉牡味?然后轉(zhuǎn)染.挑出重組子,鑒定插入片段的大小.如果文庫(kù)的大小和質(zhì)量都令人滿(mǎn)意的話(huà),就可以鋪板進(jìn)行文庫(kù)篩選,或者擴(kuò)增、保存文庫(kù).如果構(gòu)建BAC文庫(kù),應(yīng)選擇電轉(zhuǎn)法,將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入受體菌,涂板長(zhǎng)出克隆.獲得克隆后需要對(duì)BAC克隆的大小進(jìn)行評(píng)估,確定文庫(kù)大小是否能夠滿(mǎn)足要求.如果文庫(kù)大小合適,就可以進(jìn)行后續(xù)操作了.六、文庫(kù)克隆數(shù)的確定基因組DNA文庫(kù)需要包含足夠多的克隆,來(lái)保證文庫(kù)的代表性.一般使用如下的經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)確定:N=ln(1-P)/ln(1-f)P是希望得到的覆蓋率,f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值,N是所需的克隆數(shù).舉例來(lái)說(shuō),用BAC載體構(gòu)建人類(lèi)基因組文庫(kù),人類(lèi)基因組大小為3x109bp,插入片段大小為100kb,希望覆蓋率99%,那么所需要的BAC克隆數(shù)為N=ln(1-0.99)/ln(1-[106bp/3x109bp])=138,298技術(shù)支持資料:材料緩沖液和溶液-堿裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0)配制堿裂解液I約100ml,滅菌,保存在四度.-堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存0.2NNaOH(從10N的NaOH新鮮制備)1%(w/v)SDS堿裂解液II應(yīng)該新鮮配制,室溫保存.-堿裂解液III,4°C5M醋酸鉀,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-異丙醇-酚:氯仿(1:1,v/v)-醋酸鈉(3M,pH5.2)-STE,4°C10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MNaCl1mMEDTA(pH8.0)-TE(pH8.0)10mMTris-Cl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0)載體與菌株BAC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養(yǎng)基酶和緩沖液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性?xún)?nèi)切酶和相應(yīng)緩沖液核苷酸/寡核苷酸用于脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物凝膠/點(diǎn)樣緩沖液脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-fieldgels,或者0.5%瓊脂糖凝膠)離心機(jī)/轉(zhuǎn)頭/離心管其他37攝氏度搖床1.BACDNA大量提取方案(參考文獻(xiàn):Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition)此方案適合從500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以產(chǎn)生20-25μg純化的DNA.方法1.將50μlBAC轉(zhuǎn)化菌的過(guò)夜培養(yǎng)物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩(280rpm)培養(yǎng)12到16小時(shí).2.2500g,4℃,離心15min,收集菌體.3.用100ml冰預(yù)冷的STE重新懸浮細(xì)菌沉淀.按步驟2方法離心收集細(xì)菌.4.用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細(xì)菌.加溶菌酶至終濃度為1mg/ml.5.加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II.蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次,使內(nèi)容物完全混勻,冰裕5min.6.加入24ml冰預(yù)冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次,使內(nèi)容物完全混勻,置冰上5min.7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心瓶中,棄沉淀.8.加等體積的酚:氯仿.輕輕翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次,混勻.3000g,室溫離心15min.9.將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次,混勻.10.15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀.11.棄上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.棄乙醇,風(fēng)干使乙醇揮發(fā)殆盡.13.小心將BACDNA沉淀溶于0.2mlTE(pH8.0)中.2.BACDNA的小量提?。▍⒖嘉墨I(xiàn):Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition)此方案適合從5ml菌液中提取BACDNA,一般可以產(chǎn)生0.1-0.4μg的BACDNA.方法:1.挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃劇烈震搖過(guò)夜.2.2000g,4℃,離心5min,收集菌體.3.在每個(gè)離心管中加5ml預(yù)冷的STE,用移液器吹懸細(xì)菌沉淀.按步驟2離心收集細(xì)菌.4.將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中.將菌體轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II.輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次,將離心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次.將離心管置于冰上5min.7.在微量離心機(jī)上以Zda速度4℃離心5min,除去細(xì)胞碎片沉淀.將上清移入一新的微量離心管中.室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次離心管,混勻.8.立即在微量離心機(jī)上室溫下Zda速離心5min,使核酸沉淀.棄去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室溫下離心2min,吸去乙醇.室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μlTE(pH8.0)中.[詳細(xì)]
-
2018-11-16 10:02
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)助力環(huán)境保護(hù)“智慧化”
- 物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)助力環(huán)境保護(hù)“智慧化”[詳細(xì)]
-
2016-04-20 00:00
實(shí)驗(yàn)操作
-
DL-胰化蛋白氨基酸技術(shù)分析
- DL-胰化蛋白氨基酸技術(shù)分析小鼠腎素(Renin)生產(chǎn)elisa試劑盒小鼠白介素12(IL-12/P70)生產(chǎn)elisa試劑盒魚(yú)雌二醇(E2)生產(chǎn)elisa試劑盒小鼠結(jié)腸癌抗原(CCA)生產(chǎn)elisa試劑盒PALCAM瓊脂平板瓊脂糖麥芽汁瓊脂豬白介素2(IL-2)生產(chǎn)elisa試劑盒大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)生產(chǎn)elisa試劑盒大鼠骨成型蛋白4(BMP-4)生產(chǎn)elisa試劑盒DL-胰化蛋白氨基酸技術(shù)分析CAS號(hào):54-12-6C11H12N2O2=204.23級(jí)別:BR含量:≥99.0%比旋光度:0°(C=1inH2O)氯化物:≤0.020%硫酸鹽:≤0.020%銨鹽:≤0.020%鐵鹽:≤10ppm重金屬:≤10ppm砷鹽:≤1ppm干燥失重:≤0.20%灼燒殘?jiān)骸?.10%性狀:白色至黃白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,味稍甜,對(duì)光敏感。在堿液中穩(wěn)定,遇強(qiáng)酸分解。微溶于水和乙醇,不溶于氯仿和乙。熔點(diǎn)275~282℃用途:生化研究。營(yíng)養(yǎng)研究。制備組織培養(yǎng)基保存:RT,避光DL-胰化蛋白氨基酸技術(shù)分析[詳細(xì)]
-
2018-11-05 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
油墨均一性的光譜在線(xiàn)檢測(cè)
- 油墨均一性的光譜在線(xiàn)檢測(cè)[詳細(xì)]
-
2024-09-19 04:18
專(zhuān)利
-
光刻膠用色漿均一性解決方案
- 光刻膠用色漿均一性解決方案[詳細(xì)]
-
2024-09-14 10:43
應(yīng)用文章
-
染料敏化太陽(yáng)能電池-基本原理及測(cè)試
- PurposeofThisNoteThisapplicationnoteispartofaseriesconcerningdyesolarcells.Theoryandvarioustypesofexperimentsarediscussedthatareneededforcharacterizationofsolarcells.Part1ofthisseriesdiscussesbasicprinciplesofdyesolarcells,theirsetup,andunderlyingelectrochemicalmechanisms.Inaddition,characterizationofdyesolarcellsisdemonstratedbymeansofbasicelectrochemicalexperiments.[詳細(xì)]
-
2018-08-30 10:00
產(chǎn)品樣冊(cè)
-
ZG醫(yī)學(xué)科學(xué)院JBC解析抑癌miRNA
- ZG醫(yī)學(xué)科學(xué)院JBC解析抑癌miRNA[詳細(xì)]
-
2013-10-12 00:00
課件
-
電子天平如何選型-轉(zhuǎn)自百度文庫(kù).doc
- 電子天平如何選型-轉(zhuǎn)自百度文庫(kù).doc[詳細(xì)]
-
2016-02-26 00:00
標(biāo)準(zhǔn)
-
采用屈服應(yīng)力測(cè)量產(chǎn)品質(zhì)量的均一性
- 采用屈服應(yīng)力測(cè)量產(chǎn)品質(zhì)量的均一性[詳細(xì)]
-
2008-08-06 00:00
報(bào)價(jià)單
-
CMP Slurry均一性的一體化解決方案
- CMP Slurry均一性的一體化解決方案[詳細(xì)]
-
2023-02-23 11:05
應(yīng)用文章
Copyright 2004-2026 yiqi.com All Rights Reserved , 未經(jīng)書(shū)面授權(quán) , 頁(yè)面內(nèi)容不得以任何形式進(jìn)行復(fù)制
參與評(píng)論
登錄后參與評(píng)論