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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura-2)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

本文由 上??茖W(xué)儀器有限公司 整理匯編

2018-11-18 10:00 2269閱讀次數(shù)

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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura-2)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光(Fura-2)檢測(cè)試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM,與鈣離子結(jié)合后,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),在熒光分光光度儀下測(cè)量不同激發(fā)波長(zhǎng)下相對(duì)熒光峰值的比值,來測(cè)定細(xì)胞漿總鈣離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物、人體等)或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,檢測(cè)敏感。技術(shù)背景鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì),占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石鈣(calciumfluorophosphateapatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣,其構(gòu)成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣(complexedcalcium)和離子鈣(ionizedcalcium)。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性(neuromuscularexcitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi),鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法(flamephotometry)、原子吸收分光光度法等技術(shù),但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要線粒體、細(xì)胞漿分離。Fura-2AM(acetoxy-methylester),一種具有細(xì)胞膜通透性,與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料,通過其不同激發(fā)波長(zhǎng)340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比(散發(fā)波長(zhǎng)510nm)來極ng確測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。產(chǎn)品內(nèi)容清理液(ReagentA)40毫升染色液(ReagentB)30微升介導(dǎo)液(ReagentC)600微升飽和液(ReagentD)2毫升陰性液(ReagentE)2毫升裂解液(ReagentF)200微升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存染色液(ReagentB)和介導(dǎo)液(ReagentC)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里;有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器細(xì)胞培養(yǎng)箱:用于染色孵育96孔培養(yǎng)板:用于樣品操作的容器熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定準(zhǔn)備設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀:激發(fā)波長(zhǎng)340nm和380nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm測(cè)定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(ReagentB)室溫下融化,然后分別移出30微升介導(dǎo)液(ReagentC)和1.5微升染色液(ReagentB)到新的1.5毫升離心管,標(biāo)記為染色工作液,并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)準(zhǔn)備1個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,標(biāo)記為:細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞)、Zda對(duì)照孔(含細(xì)胞)小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液加入100微升清理液(ReagentA)到細(xì)胞樣品孔里加入100微升飽和液(ReagentD)到Zda對(duì)照孔里加入100微升陰性液(ReagentE)到空白對(duì)照孔里分別加入10微升染色工作液到所有孔里輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板,混勻放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液小心加入100微升清理液(ReagentA)到細(xì)胞樣品孔里重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9和10一次放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘加入5微升裂解液(ReagentF)到Zda對(duì)照孔里放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀:獲得相對(duì)熒光單位(relativefluorescenceunit;RFU)包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU340nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU380nm、Zda對(duì)照孔R(shí)FU340nm、Zda對(duì)照孔R(shí)FU380nm計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度【(樣品RFU340nm/樣品RFU380nm)-(空白對(duì)照孔R(shí)FU340nm/空白對(duì)照孔R(shí)FU380nm)÷(Zda對(duì)照孔R(shí)FU340nm/Zda對(duì)照孔R(shí)FU380nm-樣品RFU340nm/樣品RFU380nm)】X(空白對(duì)照孔R(shí)FU380nm/Zda對(duì)照孔R(shí)FU380nm)X140(納摩爾;解離常數(shù))三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測(cè)1.準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品小心加上500微升清理液(ReagentA),覆蓋樣品表面小心移去樣品上的清理液(ReagentA)移取300微升清理液(ReagentA)到新的1.5毫升離心管加入30微升染色工作液,混勻小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上,覆蓋樣品表面放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照小心移去樣品上的染色工作液小心加上500微升新鮮的清理液(ReagentA)小心移去清理液(ReagentA)小心加上500微升新鮮的清理液(ReagentA)放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘小心移去清理液(ReagentA)蓋上蓋玻片即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)340至400nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm(細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光)四、冰凍切片檢測(cè)準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的冰凍切片小心加上500微升清理液(ReagentA),覆蓋切片樣品表面小心移去樣品上的清理液(ReagentA)移取300微升清理液(ReagentA)到新的1.5毫升離心管加入30微升染色工作液,混勻小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片樣品上,覆蓋樣品表面放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照小心移去切片上的染色工作液小心加上500微升新鮮的清理液(ReagentA)小心移去清理液(ReagentA)小心加上500微升新鮮的清理液(ReagentA)放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘小心移去清理液(ReagentA)蓋上蓋玻片即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)340至400nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm(組織細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光)注意事項(xiàng)本產(chǎn)品為20次(顯微鏡)或60次(酶標(biāo)板)操作操作時(shí),須戴手套可以使用熒光分光光度儀檢測(cè)如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失,則建議使用微注射(microinjection)技術(shù)避免使用EDTA等處理樣品孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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