本文由 上海索寶生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-02 10:00 2111閱讀次數(shù)

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• 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

  1.用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗(yàn)？答：抗體的性質(zhì)對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)影響很大?？贵w不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，多抗是沉淀反應(yīng)**的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。2.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶YZ劑？答：從活性細(xì)胞裂解出來(lái)的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測(cè)蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每YZ劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。4.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？答：每次沉淀實(shí)驗(yàn)之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。5.免疫沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC（sodiumde-oxycholate），SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。[詳細(xì)]

  2018-09-02 10:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 免疫沉淀的實(shí)驗(yàn)過(guò)程

  上海金穗生物公司是一家專業(yè)經(jīng)營(yíng)生物試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑耗材的公司，生物引擎在廣大用戶的幫助和支持下，經(jīng)過(guò)不懈的努力，已成為國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的主要供應(yīng)商之一，主要經(jīng)營(yíng)ELISA試劑盒、細(xì)胞、血清、抗體、金標(biāo)試劑盒、生物試劑、耗材、培養(yǎng)基、一抗、二抗等產(chǎn)品，產(chǎn)品暢銷國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)，銷售額逐年穩(wěn)步提高。上海金穗生物公司擁有雄厚的實(shí)力、合理的價(jià)格和優(yōu)良的服務(wù)，能夠及時(shí)解決和滿足客戶的各方面的需求，公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國(guó)，在同行獲得一致好評(píng)。www.shjsbio.com[詳細(xì)]

  2018-10-08 10:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 免疫沉淀的改進(jìn)方法

  免疫沉淀的改進(jìn)方法[詳細(xì)]

  2013-11-11 00:00

  其它

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• 免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用

  上海金穗生物公司是一家專業(yè)經(jīng)營(yíng)生物試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑耗材的公司，生物引擎在廣大用戶的幫助和支持下，經(jīng)過(guò)不懈的努力，已成為國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的主要供應(yīng)商之一，主要經(jīng)營(yíng)ELISA試劑盒、細(xì)胞、血清、抗體、金標(biāo)試劑盒、生物試劑、耗材、培養(yǎng)基、一抗、二抗等產(chǎn)品，產(chǎn)品暢銷國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)，銷售額逐年穩(wěn)步提高。上海金穗生物公司擁有雄厚的實(shí)力、合理的價(jià)格和優(yōu)良的服務(wù)，能夠及時(shí)解決和滿足客戶的各方面的需求，公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國(guó)，在同行獲得一致好評(píng)。www.shjsbio.com[詳細(xì)]

  2018-10-08 10:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• V-P實(shí)驗(yàn)原理注意事項(xiàng)

  V-P實(shí)驗(yàn)原理注意事項(xiàng)（1）原理：有些細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色的化合物。若培養(yǎng)基中的胍基含量過(guò)少，則可加入少量含胍基的化合物等。（2）V-P試劑：肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。（3）實(shí)驗(yàn)方法：接種實(shí)驗(yàn)菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(與甲基紅實(shí)驗(yàn)相同)中，每次兩個(gè)重復(fù)，置適溫培養(yǎng)2-6d，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，有時(shí)需要放置更長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)紅色反應(yīng)。（4）應(yīng)用：本實(shí)驗(yàn)常與甲基紅實(shí)驗(yàn)一起用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。[詳細(xì)]

  2024-10-03 20:15

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 滬鼎生物免疫沉淀技術(shù)服務(wù)流程

  免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測(cè)。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見(jiàn)沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計(jì)的沉淀實(shí)驗(yàn)主要包括絮狀沉淀試驗(yàn)，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)。凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)依所用的實(shí)驗(yàn)方法又可分為免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和免疫電泳技術(shù)2類。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Westernblotting分析。免疫沉淀操作流程（以ProteinAAgarose方法為例）：一、蛋白樣品的準(zhǔn)備1.對(duì)于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。2.對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解。3.對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。二、去除非特異性結(jié)合1.取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的ProteinAAgarose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。2.2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。三、免疫沉淀1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動(dòng)放置一個(gè)晚上。2.再加入20微升充分重懸的ProteinAAgarose，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)。3.2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉ProteinAAgarose。4.用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升。洗滌時(shí)離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟。5.完成Z后一次洗滌后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底。6.100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。免疫共沉淀：參考免疫沉淀的方法進(jìn)行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。[詳細(xì)]

  2024-10-03 09:26

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• 凱氏定氮儀實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)

  凱氏定氮儀實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)[詳細(xì)]

  2014-05-09 00:00

  課件

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• 馬弗爐實(shí)驗(yàn)小樣灰化時(shí)注意事項(xiàng)

  馬弗爐實(shí)驗(yàn)小樣灰化時(shí)注意事項(xiàng)馬弗爐是英文Mufflefurnace翻譯過(guò)來(lái)的。Muffle是包裹的意思，furnace是爐子，熔爐的意思。馬弗爐在ZG的通用叫法有以下幾種：電爐、電阻爐、茂福爐、馬福爐。馬弗爐是一種通用的加熱設(shè)備.依據(jù)外觀形狀可分為箱式爐管式爐坩堝爐。馬弗爐屬于周期作業(yè)式，供實(shí)驗(yàn)室、工礦企業(yè)、科研單位作元素分析測(cè)定和一般小型鋼件淬火、退火、回火等熱處理時(shí)加熱用，高溫馬福爐還可作金屬、陶瓷的燒結(jié)、溶解、分析等高溫加熱用。化灰時(shí)的注意事項(xiàng)：（1）瓷舟中的試樣要攤平，且試樣的厚度不得太大;（2）灰化時(shí)可打開爐門，將耐熱板上的盛有試樣的瓷舟慢慢推進(jìn)箱形高溫電爐爐口，先使瓷舟中的試樣慢慢灰化冒煙，待幾分鐘后試樣不再冒煙時(shí)，慢慢將瓷舟推入高溫爐內(nèi)的熾熱部位，關(guān)閉爐門使試樣在815±15下灼燒。在灰化過(guò)程中如有煤樣著火爆燃，則這只煤樣就作廢必須重新稱樣灰化。（3）溫爐應(yīng)有煙囪或通風(fēng)孔，以使煤樣在灼燒過(guò)程中能排除燃燒產(chǎn)物和保持空氣的流通。（4）高溫爐的控制系統(tǒng)必須指示準(zhǔn)確。高溫爐的溫升能力必須達(dá)到測(cè)定灰分的要求。（5）灰化時(shí)間應(yīng)能保證試樣在815±15的溫度下完全灰化，但隨意延長(zhǎng)灰化時(shí)間也是不利的。上海凱朗儀器設(shè)備廠專業(yè)生產(chǎn)鼓風(fēng)干燥箱、真空干燥箱、馬弗爐、生化培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、試驗(yàn)箱、恒溫?fù)u床、水槽、水浴鍋等實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。[詳細(xì)]

  2018-10-01 10:00

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• 蛋白鹽析實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

  蛋白鹽析實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)[詳細(xì)]

  2024-09-28 15:14

  報(bào)價(jià)單

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• 水平垂直燃燒測(cè)試儀實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

  水平垂直燃燒測(cè)試儀實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)[詳細(xì)]

  2024-09-28 02:29

  選購(gòu)指南

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• 馬弗爐實(shí)驗(yàn)小樣灰化時(shí)的注意事項(xiàng)

  馬弗爐實(shí)驗(yàn)小樣灰化時(shí)的注意事項(xiàng)馬弗爐是英文Mufflefurnace翻譯過(guò)來(lái)的。Muffle是包裹的意思，furnace是爐子，熔爐的意思。馬弗爐在ZG的通用叫法有以下幾種：電爐、電阻爐、茂福爐、馬福爐。馬弗爐是一種通用的加熱設(shè)備.依據(jù)外觀形狀可分為箱式爐管式爐坩堝爐。馬弗爐屬于周期作業(yè)式，供實(shí)驗(yàn)室、工礦企業(yè)、科研單位作元素分析測(cè)定和一般小型鋼件淬火、退火、回火等熱處理時(shí)加熱用，高溫馬福爐還可作金屬、陶瓷的燒結(jié)、溶解、分析等高溫加熱用。化灰時(shí)的注意事項(xiàng)：（1）瓷舟中的試樣要攤平，且試樣的厚度不得太大;（2）灰化時(shí)可打開爐門，將耐熱板上的盛有試樣的瓷舟慢慢推進(jìn)箱形高溫電爐爐口，先使瓷舟中的試樣慢慢灰化冒煙，待幾分鐘后試樣不再冒煙時(shí)，慢慢將瓷舟推入高溫爐內(nèi)的熾熱部位，關(guān)閉爐門使試樣在815±15下灼燒。在灰化過(guò)程中如有煤樣著火爆燃，則這只煤樣就作廢必須重新稱樣灰化。（3）溫爐應(yīng)有煙囪或通風(fēng)孔，以使煤樣在灼燒過(guò)程中能排除燃燒產(chǎn)物和保持空氣的流通。（4）高溫爐的控制系統(tǒng)必須指示準(zhǔn)確。高溫爐的溫升能力必須達(dá)到測(cè)定灰分的要求。（5）灰化時(shí)間應(yīng)能保證試樣在815±15的溫度下完全灰化，但隨意延長(zhǎng)灰化時(shí)間也是不利的。上海凱朗儀器設(shè)備廠專業(yè)生產(chǎn)鼓風(fēng)干燥箱、真空干燥箱、高溫箱、電子防潮柜、箱式電爐、恒溫恒濕箱、人工氣候箱、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、隔水式培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高低溫試驗(yàn)箱、恒溫?fù)u床、水槽、水浴鍋等實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。[詳細(xì)]

  2018-10-01 10:00

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• 大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng).pdf

  大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書本試劑盒僅供研究使用。檢測(cè)范圍：96T100ng/L-1800ng/L使用目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本白細(xì)胞介素2（IL-2）含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）水平。用純化的大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細(xì)胞介素2（IL-2），再與HRP標(biāo)記的白細(xì)胞介素2（IL-2）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細(xì)胞介素2（IL-2）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（3600ng/L）0.5ml×1瓶3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶4樣品稀釋液6ml×1瓶10說(shuō)明書1份5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3YZ辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。1800ng/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液900ng/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液450ng/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液225ng/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液112.5ng/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品Z終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，**做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔**孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)Z后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物請(qǐng)避光保存。7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10.如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。保存條件及有效期1．試劑盒保存：；2-8℃。2．有效期：6個(gè)月上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，專業(yè)生產(chǎn)代理各種elisa試劑盒，質(zhì)量保證，值得信賴，如果你想了解更多關(guān)于試劑盒的詳細(xì)信息，歡迎來(lái)電來(lái)函！聯(lián)系電話：021-60515410,18221290082！[詳細(xì)]

  2018-11-15 10:03

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  2018-09-28 10:00

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