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滬鼎生物免疫沉淀技術(shù)服務(wù)流程

本文由 上海滬鼎生物科技有限公司 整理匯編

2024-10-03 09:26 903閱讀次數(shù)

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免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下,按適當(dāng)比例所形成的可見沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計的沉淀實驗主要包括絮狀沉淀試驗,環(huán)狀沉淀試驗和凝膠內(nèi)的沉淀試驗。凝膠內(nèi)的沉淀試驗依所用的實驗方法又可分為免疫擴(kuò)散實驗和免疫電泳技術(shù)2類。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體,與抗原形成特異免疫復(fù)合物,經(jīng)過洗脫,收集免疫復(fù)合物,然后進(jìn)行SDS-PAGE及Westernblotting分析。免疫沉淀操作流程(以ProteinAAgarose方法為例):一、蛋白樣品的準(zhǔn)備1.對于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞,吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌一次,然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。2.對于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解。3.對于懸浮細(xì)胞,離心收集細(xì)胞后,PBS洗滌一次,然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。二、去除非特異性結(jié)合1.取200微升至1毫升蛋白樣品,蛋白量約為200微克至1毫克,加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的ProteinAAgarose,4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。2.2500rpm(約1000g)離心5分鐘,取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。三、免疫沉淀1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃緩慢搖動放置一個晚上。2.再加入20微升充分重懸的ProteinAAgarose,4℃緩慢搖動1-3個小時。3.2500rpm(約1000g)離心5分鐘,或瞬時高速離心,小心吸除上清,注意寧可留下少量上清也不能吸掉ProteinAAgarose。4.用準(zhǔn)備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟。5.完成Z后一次洗滌后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀,瞬時高速離心把樣品離心至管底。6.100℃或沸水浴處理3-5分鐘,取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳,暫時不用的樣品可以-20℃保存。免疫共沉淀:參考免疫沉淀的方法進(jìn)行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品,但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。

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