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細(xì)胞CDK2/CYCLIN A激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量

本文由 上海科學(xué)儀器有限公司 整理匯編

2018-11-18 10:00 780閱讀次數(shù)

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主要用途細(xì)胞CDK2/CYCLINA激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過熒光探針EDANS供體和DABCYL受體雙重標(biāo)記的多肽底物,在CDK2/CYCLINEYZ劑的存在下,受到CDK2/CYCLINA的磷酸化后,不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離,而發(fā)生熒光峰值的降低,即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或完全純化酶樣品中CDK2/CYCLINA激酶的特異活性定量檢測(cè),以及YZ劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,安全可靠。技術(shù)背景細(xì)胞周期素依賴性激酶2(cyclindependentkinase2;CDK2;EC2.7.11.22),又稱為細(xì)胞分裂周期蛋白1(celldivisioncycle1;CDC1)或p33,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonineproteinkinase)家屬成員之一。其與酵母細(xì)胞的cdc28和cdc2高度進(jìn)化保留。細(xì)胞周期素依賴性激酶2的催化亞體,與細(xì)胞周期素E然后A結(jié)合,允許細(xì)胞由G1期進(jìn)入DNA合成期,達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等。p21Cip1(CDKN1A)andp27Kip1(CDKN1B)是CDK2激酶的YZ劑。CDK2/CYCLINA激酶的磷酸化目標(biāo)序列為HHASPRK?;诹姿峄嚯木哂锌拱被拿盖须x的功能,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescenceresonanceenergytransfer;FRET),即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體(donor)到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體(acceptor),使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅(quench),使用2個(gè)熒光探針EDANS供體和DABCYL受體作為FRET對(duì),來標(biāo)記的CDK2多肽底物的兩端,在氨基肽酶(aminopeptidase)的作用下,釋放出強(qiáng)烈熒光的EDANS;一旦在CDK2/CYCLINEYZ劑二氨基吡唑-1氫4-基偶氮酚【4-(3,5-diamino-1H-pyrazol-4-ylazo)-phenol】的存在下,底物受到CDK2/CYCLINA的磷酸化(由ATP的γ-磷酸根到多肽上單一絲氨酸殘基分子上),底物將不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離,而無法釋放出EDANS,由此根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)340nm,散發(fā)波長(zhǎng)490nm)的降低,來定量測(cè)定細(xì)胞周期素依賴性激酶2/細(xì)胞周期素A的特異活性。CDK2/CYCLINA反應(yīng)系統(tǒng)為:

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