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細(xì)胞凋亡檢測-形態(tài)學(xué)特征的檢測方法

本文由 上海研生實業(yè)有限公司 整理匯編

2018-09-28 10:00 1195閱讀次數(shù)

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一、普通光學(xué)顯微鏡觀察方法1)蘇木素-伊紅染色(HE染色法)石蠟組織切片的HE染色1.取材組織塊,經(jīng)固定后,常規(guī)石蠟包埋,4μm切片。2.切片常規(guī)用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇至水洗:二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸餾水洗2min。3.蘇木素染色5min,自來水沖洗。4.鹽酸乙醇分化30s(提插數(shù)下)。5.自來水浸泡15min或溫水(約50℃)5min。6.置伊紅液2min。7.常規(guī)脫水,透明,封片:95%乙醇(I)min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3:1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性樹脂封固。2)甲基綠-派諾寧染色法1.新鮮取材組織固定液中4℃固定3~6小時。2.直接轉(zhuǎn)入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。3.切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化至蒸餾水。4.置染色液中室溫下染片約1h。5.取出切片,不經(jīng)水洗,用濾紙吸干多余染液。6.插入丙酮中迅速分化。7.轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。8.二甲苯透明2~3次。9.中性樹膠封固。3)Giemsa染色1.收集細(xì)胞(1×106),PBS洗1次。2.用細(xì)胞涂片離心機(jī)制成細(xì)胞涂片。3.甲醇固定3~5min。4.入Giemsa稀釋染色液15~30min,冬天在37℃溫箱中染色。5.用磷酸鹽緩沖液分色,以鏡下控制為準(zhǔn)。6.涂片晾干后用中性樹膠封片。4)瑞氏(Wright)染色1.收集細(xì)胞(1×106),PBS洗1次。2.用細(xì)胞涂片離心機(jī)制成細(xì)胞涂片。3.甲醇固定3~5min。4.用Wright液染色2min。5.入Wright磷酸緩沖液稀釋液4~10min,然后用蒸餾水沖洗。此時如果顏色較深,可0.08%醋酸分化數(shù)秒鐘6.直立晾干后,用中性樹膠封固。二、透射電子顯微鏡觀察方法1)透射電鏡樣本的取材和固定培養(yǎng)細(xì)胞的取材和固定1.常規(guī)收集帖壁和懸浮細(xì)胞,置離心管中離心,800~1000r/min,10min。2.用0.01mol/LPBS5ml重懸細(xì)胞。3.將細(xì)胞懸液吸入有瓊脂空槽的離心管中。4.離心,2000r/min,15~20min,使細(xì)胞成團(tuán)。5.小心吸去上清,加入2.5%戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán),以免細(xì)胞團(tuán)散開。6.取出離心管內(nèi)的瓊脂,仔細(xì)切下尖槽內(nèi)含有細(xì)胞團(tuán)的瓊脂塊。7.將含細(xì)胞的團(tuán)瓊脂塊投入含戊二醛固定液的小瓶中,4℃(可長期)保存。8.用0.1mol/LPBS緩沖液洗1次。9.1%鋨酸后固定30~60min。三、熒光顯微鏡觀察方法1)吖啶橙染色法1.制備活細(xì)胞懸液,濃度約為107/ml。2.取95μl的細(xì)胞懸液,加5μl的吖啶橙貯存液混勻。3.吸一滴混合液點(diǎn)潔凈玻片上,直接用蓋玻片封片。4.熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片BG12或BV等,阻斷濾片用515nm或SP3。2)Hoechst33258染色法1.原代細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞學(xué)涂片或細(xì)胞甩片機(jī)制備的單細(xì)胞片。2.細(xì)胞固定液4℃固定5min。3.蒸餾水稍洗后,點(diǎn)加Hoechst33258染色液,10min。4.蒸餾水洗片后,用濾紙沾去多余液體。5.封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。3)Hoechst33342染色法1.將Hoechst33342加入培養(yǎng)的細(xì)胞中,終濃度為10μg/ml37℃孵育30min。2.4%的多聚甲醛和培養(yǎng)液以1:3混合,使多聚甲醛的濃度為1%,固定細(xì)胞5~10min。3.固定好后,將細(xì)胞懸液涂在載玻片加蓋玻片。4.熒光顯微鏡激發(fā)濾片選用UV激發(fā)濾片,阻斷濾片為400~500nm。以上是先將細(xì)胞染色后再行固定觀察的方法,也可先固定后染色:1.收集(0.5~3.0)×106個細(xì)胞,500~1000r/min,離心5min去上清。2.PBS洗1次,500~1000r/min,離心5min去PBS。3.用3%多聚甲醛50μl重懸細(xì)胞,室溫下固定10min。4.PBS洗1次,500~1000r/min離心5min去PBS。5.用15μl的Hoechst33258或33342重懸細(xì)胞,終濃度為16μg/ml,孵育15min。6.取10μl放在玻片上,熒光顯微鏡下觀察,可數(shù)500個細(xì)胞,計算調(diào)亡率。

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