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堿性磷酸酶研究應(yīng)用

本文由 上海研生實(shí)業(yè)有限公司 整理匯編

2024-09-29 00:09 952閱讀次數(shù)

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堿性磷酸酶也是目前免疫診斷試劑產(chǎn)品Z常用的標(biāo)記酶之一。與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)相比,ALP用作標(biāo)記酶的優(yōu)點(diǎn)是,穩(wěn)定性高、靈敏度高,缺點(diǎn)是成本高,標(biāo)記困難?! ≡谘芯恐衂常用的ALP如下:  ◇細(xì)菌堿性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase(BAP),來(lái)源:EscherichiacoliC4;  ◇Shrimpalkalinephosphatase(SAP),來(lái)源:一種北極蝦(Pandalusborealis);  ◇小牛腸堿性磷酸酶CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIP);  ◇胎盤堿性磷酸酶Placentalalkalinephosphatase(PALP)和分泌性堿性磷酸酶thesecretedalkalinephosphatase(SEAP),后者是前者的C末端短缺版與PALP相比,SEAP沒(méi)有PALP的C末端Z后24個(gè)氨基酸(這24個(gè)氨基酸構(gòu)成了與糖基化磷脂酰肌醇靶向錨定的區(qū)域)  ALP主要應(yīng)用于分子生物學(xué)和酶免分析中:  ★分子生物學(xué)中主要用作核酸的去磷酸化。因?yàn)镈NA通常會(huì)在5'端結(jié)合磷酸基團(tuán),用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端與3'端連接,從而在后續(xù)步驟準(zhǔn)備好之前讓DNA分子YZ處于線性化狀態(tài);同樣,通過(guò)去磷酸化可用作放射標(biāo)記示蹤。通常用作這些目的用的Z多的是Shrimpalkalinephosphatase(SAP),因?yàn)樵诜磻?yīng)完成之后它是Z容易滅活的?!  锩该夥治鲋袘?yīng)用Z多的是ELISA,以競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原為例,抗體先與固相載體結(jié)合,然后讓待測(cè)樣品與事先經(jīng)ALP標(biāo)記過(guò)的該抗原競(jìng)爭(zhēng)地與抗體結(jié)合,洗去未反應(yīng)的過(guò)量ALP-抗原,加入顯色底物。則可以通過(guò)與按梯度濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)品繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比從而知道待測(cè)樣品中抗原的濃度。ELISA中用的比較多的是辣根過(guò)氧化物酶(HRP),底物為OPD,深桔黃色,檢測(cè)波長(zhǎng)492nm;TMB,藍(lán)綠色,檢測(cè)波長(zhǎng)450nm堿性磷酸酶,底物為PNPP(對(duì)-消基苯磷酸酯),黃色,檢測(cè)波長(zhǎng)405nm  ★目前工業(yè)上一個(gè)普遍的應(yīng)用是作為檢驗(yàn)牛奶的巴斯的滅菌的標(biāo)志:被巴斯德過(guò)高溫滅菌的分子會(huì)被滅活,向其中和未巴斯滅菌的牛奶中加入ALP的底物,2分鐘后未滅菌的樣品應(yīng)該顯黃色,如果待測(cè)樣品(指被巴斯滅菌過(guò)的牛奶)也能呈現(xiàn)相同顏色,則說(shuō)明巴斯滅菌溫度未過(guò)度。當(dāng)然總有例外,因?yàn)橛猩贁?shù)細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生耐熱的ALP。

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