做Western Blot的小伙伴，你是不是還在那里熬夜趕實驗？是不是還在糾結(jié)今天的結(jié)果怎么和昨天的差異這么大？是不是在為選擇哪種檢測方法而煩惱？在為實驗的重復(fù)性而抓狂？今天小編就和大家聊一下Western Blot中遇到的問題以及應(yīng)對方法。

歸一化問題：

做Western Blot經(jīng)常需要對蛋白進(jìn)行歸一化，經(jīng)典的歸一化方法是看家蛋白歸一化，看家蛋白需要選擇在不同樣品間穩(wěn)定表達(dá)的蛋白；其次表達(dá)豐度也需要篩選，如果豐度過高，目的蛋白豐度與看家蛋白差異過大，那兩者檢測定量時就不在一個線性范圍。這樣的篩選過程非常耗時耗力。即使篩選到合適的看家蛋白，對其歸一化的過程也需要多次重復(fù)調(diào)節(jié)才可以。

檢測靈敏度問題：

小編做Western Blot檢測時，由于目的蛋白含量低經(jīng)常曝光不出來，同時老儀器檢測靈敏度不夠高，只能不斷調(diào)整實驗，提高上樣量，再反復(fù)進(jìn)行摸索，做Western 做到懷疑人生。

蛋白定量重復(fù)性問題：

Western Blot檢測時，化學(xué)發(fā)光依賴酶活性和底物濃度，發(fā)光信號不穩(wěn)定，因此定量時容易出現(xiàn)誤差，重復(fù)性相對較差，也只能不斷實驗來進(jìn)行調(diào)整和驗證。

多個目的蛋白檢測問題：

Western Blot檢測時，有時需要對多個蛋白進(jìn)行檢測，這時的實驗就會變的繁瑣，需要對每一個蛋白進(jìn)行表達(dá)檢測，剪膜，剝離膜經(jīng)常要做，但是經(jīng)過這些步驟又會影響定量的JZ性，小編也很為難。

那么上述問題有沒有好的解決方法呢？這里悄悄告訴大家一個好消息，采用Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)，可以很好的解決上述困擾，好文章也在向你招手。

Sapphire成像系統(tǒng)采用雙模式，既有掃描式又有CCD成像式；多達(dá)四激光激發(fā)用于熒光成像，每個通道配有自己獨立的檢測器，PMT檢測器用于藍(lán)光成像，3個APD檢測分別用于綠光、紅光和近紅外檢測，高分辨率CCD用于化學(xué)發(fā)光檢測，在全光譜范圍內(nèi)避免信號損失；動態(tài)范圍可達(dá)6log；軟件操作簡單，易于上手。

應(yīng)對均一化問題，已有眾多期刊建議采用總蛋白均一化，總蛋白均一化能夠更加真實的反應(yīng)目的蛋白表達(dá)量的變化，同時也無需繁瑣的篩選看家蛋白、調(diào)整蛋白上樣，只需對總蛋白進(jìn)行染色和調(diào)整，Azure提供總蛋白歸一化試劑和相應(yīng)的AzureSpot分析軟件，輕松搞定蛋白均一化問題 。

應(yīng)對低豐度蛋白檢測問題，Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)可以加配610萬像素，大光圈的優(yōu)質(zhì)CCD檢測器，其檢測靈敏度可以達(dá)到fg級，動態(tài)范圍是傳統(tǒng)膠片的4倍?？梢赃M(jìn)行累積曝光，可以快速得到你需要的圖像，無需多次重復(fù)和改變上樣。

應(yīng)對重復(fù)性問題，熒光檢測方法與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光不同，熒光檢測方法不依賴酶活性和底物，二抗標(biāo)記熒光基團，信號強度和上樣量成線性關(guān)系，信號持久，可以得到更好的重復(fù)性結(jié)果，實驗可以快速完成。

應(yīng)對多種蛋白檢測問題，熒光檢測的一個好處是，無需剝離和重孵育，即可在一張印跡膜上進(jìn)行多種蛋白的檢測，減少蛋白變化的誤差，實現(xiàn)jingzhun定量。

Azure Sapphire雙模式成像系統(tǒng)

無需再為Western實驗所累

化學(xué)發(fā)光Western Blot的流程大家再熟悉不過，近紅外熒光Western與化學(xué)發(fā)光步驟基本相似，但是有些小伙伴做不好熒光Western，小編給大家總結(jié)了做熒光Western的幾點注意事項：

一、做近紅外熒光Western選擇低熒光背景膜，降低膜對信號的影響。

二、選擇合適的封閉液，沒有一種封閉液適用所有的Western Blot檢測，需要大家進(jìn)行優(yōu)化，如果做磷酸化蛋白檢測，不建議使用牛奶為基礎(chǔ)的封閉液，如果做酪氨酸蛋白，不建議使用BSA為基礎(chǔ)的封閉液，Azure提供熒光封閉試劑，減少非特異性條帶結(jié)合，降低背景。

三、漂洗也是非常重要的一步，使用干凈的孵育盒，足夠多的漂洗液，一般含有吐溫的濃度0.1%-0.2%，如果背景特別高，加入少量的SDS可以明顯降低背景，SDS添加只能用于PVDF膜，濃度一般為0.01%-0.02%。Azure提供熒光印跡漂洗buffer，減少熒光二抗的非特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生高信噪比的印跡。

四、選擇特異性好的抗體，兩種一抗必須來自不同的宿主，才能被不同特異性的二抗所識別。Azure提供熒光標(biāo)記試劑盒，熒光Western Blot實驗試劑盒和近紅外二抗，滿足客戶的需求。

五、近紅外熒光印跡膜的成像，需要成像儀器具有近紅外熒光光源，現(xiàn)在進(jìn)行近紅外染料激發(fā)zuihao的激光光源，Azure Imager和Sapphire都采用的激光光源，具有激發(fā)強度大，單色性好，信噪比高，背景低等特點。

Azure為大家提供了全套的解決方案

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細(xì)胞異質(zhì)性是腫瘤研究，干細(xì)胞研究，免疫學(xué)研究的極其重要的研究方向。單細(xì)胞研究是

分析細(xì)胞異質(zhì)性的主要手段。單細(xì)胞組學(xué)研究也是jing準(zhǔn)醫(yī)學(xué)首要的研究領(lǐng)域。

美國ProteinSimple公司首推基于芯片Western Blot技術(shù)，進(jìn)行單個細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平定

量分析系統(tǒng): Milo.

Milo具有極其強大的功能：

1. 單張芯片進(jìn)行1000個單細(xì)胞western blot

2. 每個單細(xì)胞可進(jìn)行數(shù)十個靶蛋白檢測

3. 僅需使用Western blot驗證抗體，具有抗體通用性

4. 基于western blot技術(shù)，蛋白進(jìn)行分離后檢測，提高免疫學(xué)檢測特異性

5. 全程檢測只需4小時

期刊對Western Blot數(shù)據(jù)要求：

1. 內(nèi)參和目的蛋白在同一張印跡膜上；

2. zuihao選擇膜染色進(jìn)行總蛋白歸一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表達(dá)穩(wěn)定并且不受實驗條件影響的證據(jù)；

4. 成像方法的線性范圍需要提供。

看家蛋白一般常用于內(nèi)參質(zhì)控，整張膜上的weiyi質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但是看家蛋白一般表達(dá)量比較高，可能與目的蛋白不在一個線性范圍內(nèi)，影響定量；并且看家蛋白證明在多種實驗條件下是會發(fā)生變化，例如：細(xì)胞融合，疾病和藥物ZL等等，影響定量jingzhun性。

總蛋白質(zhì)控直接在膜上檢測總蛋白，變異性小，誤差小，動態(tài)范圍更寬，使用整個泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推薦使用總蛋白進(jìn)行歸一化。

Azure可提供一站式Western Blot歸一化解決方案。

提供兩種總蛋白染色試劑Azure Red和TotalStainQ進(jìn)行膜染色和總蛋白歸一化，AzureRed適合低豐度表達(dá)樣品，TotalStain更適合細(xì)胞裂解液樣品。

Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)和Azure Imager多功能分子成像系統(tǒng)可進(jìn)行總蛋白歸一化，成像更簡單，歸一化更方便。

Azure成像系統(tǒng)除了可進(jìn)行Western Blot成像外，功能非常強大，可進(jìn)行凝膠、In cell Western孔板成像、2D和2D-DIGE、微陣列芯片、切片、動植物組織、小鼠成像、放射性同位素磷屏成像等。

做Western Blot的小伙伴，是不是還在為歸一化方法而糾結(jié)呢？今天小編就和大家匯總一下看家蛋白和總蛋白歸一化的方法。

看家蛋白歸一化

使用看家蛋白的缺點是在樣品間和不同條件下表達(dá)水平可能不一致。如使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費時間和精力來驗證內(nèi)參的選擇。

使用看家蛋白的第二個重大挑戰(zhàn)是它們的表達(dá)豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達(dá)非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，如果感興趣的蛋白不是同樣的表達(dá)豐度，那這兩種蛋白質(zhì)就不在同一線性檢測范圍內(nèi)。

如果您正在進(jìn)行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當(dāng)實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這就變得越來越困難。

總蛋白歸一化

使用總蛋白歸一化，是直接在膜上檢測總蛋白，并且該值在歸一化時用作分母。總蛋白染色提供更寬的動態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

與使用看家蛋白相比，圖像采集后的分析工作流程基本不變; 整個泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊會推薦使用總蛋白歸一化方法。

使用總蛋白染色劑對膜進(jìn)行染色提供了質(zhì)控優(yōu)勢，可以驗證轉(zhuǎn)印是否完全。

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Western blot化學(xué)發(fā)光(ECL)時，出現(xiàn)非特異條帶，應(yīng)該怎么辦？