Western blot化學(xué)發(fā)光(ECL)時，出現(xiàn)非特異條帶，應(yīng)該怎么辦？

細胞異質(zhì)性是腫瘤研究，干細胞研究，免疫學(xué)研究的極其重要的研究方向。單細胞研究是

分析細胞異質(zhì)性的主要手段。單細胞組學(xué)研究也是jing準(zhǔn)醫(yī)學(xué)首要的研究領(lǐng)域。

美國ProteinSimple公司首推基于芯片Western Blot技術(shù)，進行單個細胞蛋白質(zhì)表達水平定

量分析系統(tǒng): Milo.

Milo具有極其強大的功能：

1. 單張芯片進行1000個單細胞western blot

2. 每個單細胞可進行數(shù)十個靶蛋白檢測

3. 僅需使用Western blot驗證抗體，具有抗體通用性

4. 基于western blot技術(shù)，蛋白進行分離后檢測，提高免疫學(xué)檢測特異性

5. 全程檢測只需4小時

期刊對Western Blot數(shù)據(jù)要求：

1. 內(nèi)參和目的蛋白在同一張印跡膜上；

2. zuihao選擇膜染色進行總蛋白歸一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表達穩(wěn)定并且不受實驗條件影響的證據(jù)；

4. 成像方法的線性范圍需要提供。

看家蛋白一般常用于內(nèi)參質(zhì)控，整張膜上的weiyi質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但是看家蛋白一般表達量比較高，可能與目的蛋白不在一個線性范圍內(nèi)，影響定量；并且看家蛋白證明在多種實驗條件下是會發(fā)生變化，例如：細胞融合，疾病和藥物ZL等等，影響定量jingzhun性。

總蛋白質(zhì)控直接在膜上檢測總蛋白，變異性小，誤差小，動態(tài)范圍更寬，使用整個泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推薦使用總蛋白進行歸一化。

Azure可提供一站式Western Blot歸一化解決方案。

提供兩種總蛋白染色試劑Azure Red和TotalStainQ進行膜染色和總蛋白歸一化，AzureRed適合低豐度表達樣品，TotalStain更適合細胞裂解液樣品。

Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)和Azure Imager多功能分子成像系統(tǒng)可進行總蛋白歸一化，成像更簡單，歸一化更方便。

Azure成像系統(tǒng)除了可進行Western Blot成像外，功能非常強大，可進行凝膠、In cell Western孔板成像、2D和2D-DIGE、微陣列芯片、切片、動植物組織、小鼠成像、放射性同位素磷屏成像等。

做Western Blot的小伙伴，是不是還在為歸一化方法而糾結(jié)呢？今天小編就和大家匯總一下看家蛋白和總蛋白歸一化的方法。

看家蛋白歸一化

使用看家蛋白的缺點是在樣品間和不同條件下表達水平可能不一致。如使用看家蛋白進行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費時間和精力來驗證內(nèi)參的選擇。

使用看家蛋白的第二個重大挑戰(zhàn)是它們的表達豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，如果感興趣的蛋白不是同樣的表達豐度，那這兩種蛋白質(zhì)就不在同一線性檢測范圍內(nèi)。

如果您正在進行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當(dāng)實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這就變得越來越困難。

總蛋白歸一化

使用總蛋白歸一化，是直接在膜上檢測總蛋白，并且該值在歸一化時用作分母?？偟鞍兹旧峁└鼘挼膭討B(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

與使用看家蛋白相比，圖像采集后的分析工作流程基本不變; 整個泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊會推薦使用總蛋白歸一化方法。

使用總蛋白染色劑對膜進行染色提供了質(zhì)控優(yōu)勢，可以驗證轉(zhuǎn)印是否完全。

Azure提供全套的總蛋白歸一化解決方案。咨詢請撥打：電話：010-57256059