做Western Blot的小伙伴，是不是還在為歸一化方法而糾結(jié)呢？今天小編就和大家匯總一下看家蛋白和總蛋白歸一化的方法。

看家蛋白歸一化

使用看家蛋白的缺點(diǎn)是在樣品間和不同條件下表達(dá)水平可能不一致。如使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費(fèi)時(shí)間和精力來驗(yàn)證內(nèi)參的選擇。

使用看家蛋白的第二個(gè)重大挑戰(zhàn)是它們的表達(dá)豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達(dá)非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，如果感興趣的蛋白不是同樣的表達(dá)豐度，那這兩種蛋白質(zhì)就不在同一線性檢測范圍內(nèi)。

如果您正在進(jìn)行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個(gè)挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當(dāng)實(shí)驗(yàn)在同一印跡上檢查多種目的蛋白時(shí)，這就變得越來越困難。

總蛋白歸一化

使用總蛋白歸一化，是直接在膜上檢測總蛋白，并且該值在歸一化時(shí)用作分母。總蛋白染色提供更寬的動態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

與使用看家蛋白相比，圖像采集后的分析工作流程基本不變; 整個(gè)泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊會推薦使用總蛋白歸一化方法。

使用總蛋白染色劑對膜進(jìn)行染色提供了質(zhì)控優(yōu)勢，可以驗(yàn)證轉(zhuǎn)印是否完全。

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期刊對Western Blot數(shù)據(jù)要求：

1. 內(nèi)參和目的蛋白在同一張印跡膜上；

2. zuihao選擇膜染色進(jìn)行總蛋白歸一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表達(dá)穩(wěn)定并且不受實(shí)驗(yàn)條件影響的證據(jù)；

4. 成像方法的線性范圍需要提供。

看家蛋白一般常用于內(nèi)參質(zhì)控，整張膜上的weiyi質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但是看家蛋白一般表達(dá)量比較高，可能與目的蛋白不在一個(gè)線性范圍內(nèi)，影響定量；并且看家蛋白證明在多種實(shí)驗(yàn)條件下是會發(fā)生變化，例如：細(xì)胞融合，疾病和藥物ZL等等，影響定量jingzhun性。

總蛋白質(zhì)控直接在膜上檢測總蛋白，變異性小，誤差小，動態(tài)范圍更寬，使用整個(gè)泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推薦使用總蛋白進(jìn)行歸一化。

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做Western Blot的小伙伴，是不是還在為選擇何種歸一化方法而糾結(jié)，看家蛋白還是總蛋白？期刊都推薦總蛋白了，那看家蛋白數(shù)據(jù)還能用嗎？看家蛋白有哪些優(yōu)點(diǎn)和挑戰(zhàn)，需要注意什么？如何選擇看家蛋白呢？如選擇總蛋白歸一化，用什么總蛋白試劑進(jìn)行歸一化，如何進(jìn)行歸一化，優(yōu)點(diǎn)和挑戰(zhàn)是什么？

本周邀請Azure Biosystems產(chǎn)品應(yīng)用專家劉楚珠給正在迷茫中的小伙伴解惑。

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