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  白巧克力0603 2018-03-01 16:47:19

  大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化，常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。溴化乙錠通過(guò)嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。Z后， 超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多溴化乙錠，直至達(dá)到飽和( 每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的shou選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中Z好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級(jí)沉淀法，Z近已得到改進(jìn)(R.Treisman，個(gè)人通訊)并達(dá)到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級(jí)沉淀法與氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法有一點(diǎn)不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA 分開(kāi)，因此， 純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒(大于15kb)及用于生物物理學(xué)測(cè)定的閉環(huán)質(zhì)粒時(shí)、平衡離心仍是shou選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體。

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