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  微影中心1 2017-11-16 00:00:00

  質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測(cè) 摘要 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿變性法提取E.coli DH5α(pUC19)的質(zhì)粒DNA，并且通過(guò)一系列的分離純化技術(shù)將其質(zhì)粒DNA與染色體DNA、RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分開(kāi)從而得到純化的質(zhì)粒DNA分子。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可以通過(guò)DNA條帶的位置來(lái)大致判斷其分子大小，也可以將實(shí)際電泳的結(jié)果和理論結(jié)果相對(duì)比，分析差異產(chǎn)生原因，從而完善實(shí)驗(yàn)方法，嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)步驟。 關(guān)鍵詞堿變性法分離純化技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳 引言 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。一些質(zhì)粒永遠(yuǎn)獨(dú)立于染色體之外，另外一些質(zhì)粒在一定條件下會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(DNA)。質(zhì)粒在基因工程中是一類重要的載體，其作用主要是攜帶一些基因片段(可以是編碼基因，也可以是調(diào)控區(qū)等)，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行表達(dá)或參與通路的相互作用，通過(guò)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞可以探究基因相互作用關(guān)系，取得蛋白產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)特定基因片段的克隆等?？傊?，質(zhì)粒在生物科學(xué)研究方面具有廣泛的作用。 提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有:堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-***化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法Z為經(jīng)典和常用。堿裂解/堿變性法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的的分離方法。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性;質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中;染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)，通過(guò)離心被除去。Z后，質(zhì)粒DNA用冰乙醇沉淀獲得。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/***仿抽提除去，Z后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。 電泳(electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠電泳是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠是電泳支持介質(zhì)，具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，此時(shí)移動(dòng)的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng) 速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段。 正文 1.材料和方法 1.1材料和試劑 實(shí)驗(yàn)材料:E.coli DH5α(pUC19)。 實(shí)驗(yàn)試劑:LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(Amp)母液(儲(chǔ)存濃度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM EDTA (pH 8.0);溶液Ⅱ:0.2MNaOH，1% SDS;溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8);TE溶液:10mM Tris-HCl，1mM EDTA (pH 8.0);冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris飽和酚、***仿/異戊醇混合液、酚/***仿/異戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、滅菌雙蒸水ddH2O、50×TAE緩沖液、10mg/mL溴化乙錠(EB)溶液、6×上樣緩沖液(6×loading buffer)。 1.2實(shí)驗(yàn)方法 大腸桿菌的增值 用牙簽從LB固體培養(yǎng)基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落于LB+Amp(Amp工作濃度為100μg/mL)液體培養(yǎng)基中，置于37℃、200rpm培養(yǎng)箱下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 (1)用搪瓷杯取一杯冰。 (2)將小燒杯放在天平上，調(diào)至平衡。 (3)配置80ml溶液Ⅱ: 將原液10M NaOH，10% SDS配制成0.2M NaOH，1% SDS。取用8ml SDS，1.6ml NaOH和70.4ml蒸餾水配置。 3. E.coil菌株的收獲( 4°C操作) (1)取一個(gè)滅菌離心管，稱重，標(biāo)記為W1 14.552g (2)倒入菌液至距瓶口1/3處，兩兩配平 (3) 6000rpm，離心5min，棄上清 (4)加入5ml 溶液Ⅰ，渦旋， 6000rpm，5min，棄上清，稱重為W2 14.676g，計(jì)算W2-W1 0.124g。 4.細(xì)胞裂解提取質(zhì)粒DNA ( 4°C操作) 向菌體沉淀中量加入(按菌體量接近的重新分組，溶液Ⅰ補(bǔ)平) (1)2.0 mL 溶液Ⅰ，充分渦旋振蕩;用溶液Ⅰ再次配平 (2)4.0 mL溶液Ⅱ，輕柔顛倒混勻，冰浴3-5mi (3)3.0 mL 溶液Ⅲ，輕柔顛倒混勻，冰浴5mi (4)12000rpm， 15min;小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)，記錄體積V。 (5)加入2V冰乙醇，顛倒混勻;-20℃，15min;。 (6)12000rpm，15min，棄上清。 (7)加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸棄上清。 (8)重復(fù)乙醇洗滌一次;37℃風(fēng)干5-10min。 (9)分次加入0.5mL TE溶液兩次，將沉淀吹開(kāi)吹勻，并移到Ep管中，得質(zhì)粒DNA粗提物 (10)加入5μl RNase A(10mg/ml)，終濃度為50μg/mL，37℃孵育1-2小時(shí)。 5.質(zhì)粒DNA的純化 將1mL質(zhì)粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中，使得每組兩管。每個(gè)EP管進(jìn)行如下操作: (1)加入等體積的Tris飽和酚，渦旋振蕩，12000rpm，5mi (2)轉(zhuǎn)移上清V1(兩管均為400μL)至新管，加入V1的酚/***仿/異戊醇混合液，渦旋振蕩(<1min)，12000rpm，5mi (3)轉(zhuǎn)移上清V2(一管為400μL，一管為378μL)至新管，加入V2的***仿/異戊醇混合液，渦旋振蕩(<1min)，12000rpm，5mi (4)轉(zhuǎn)移上清V3(兩管均為250μL)至新管，加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2)，再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇，震蕩混勻，-20℃保存30mi (5)12000rpm，15min，棄上清 (6)加入500μL 70%乙醇洗滌，12000rpm離心2min，棄上清 (7)重復(fù)洗滌一次，吸棄上清，37℃風(fēng)干5mi (8)每管加入25μL TE溶解沉淀，合并，得50μL純化質(zhì)粒DNA。 6. 1% 瓊脂糖凝膠的制備 (1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE，用雙蒸水將其稀釋至2L (2)正確組裝制膠槽、制膠板、樣品梳 內(nèi)容來(lái)自淘豆網(wǎng)www.taodocs.com轉(zhuǎn)載請(qǐng)標(biāo)明出處. 第2頁(yè) /(共3頁(yè)) 文檔介紹： (3)取40mL 1×TAE至250mL干凈紅蓋瓶中，稱量0.4g瓊脂糖，混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒 (4)待溶液冷卻至60℃左右，加入20μL 1mg/mL的溴化乙錠(EB)溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/L，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用(冷卻凝固時(shí)間要在30min以上)。 7.電泳上樣 (1)取2.0μL純化DNA、2μL雙蒸水、1μL上樣緩沖液(6×loading buffer)，用微量移液器吹吸混勻 (2)將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm (3)將上述混合好的DNA樣品，按照下表順序，點(diǎn)樣到凝膠中。。 8.凝膠電泳與DNA分離 (1)開(kāi)啟電泳儀電源，選擇合適的電壓120V和時(shí)間40mi (3)將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連 (4)啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi) (5)電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表 DNA樣品加樣順序 泳道 DNA 樣品/ marker 超螺旋marker UC19 UC19/HindⅢ 1組DNA樣品 2組DNA樣品 3組DNA樣品 4組DNA樣品 5組DNA樣品 超螺旋marker 樣量 6μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 6μL 泳道 10 11 12 13 14 15 16 17 DNA 樣品/ marker 6組DNA樣品 6組DNA樣品(陽(yáng)性對(duì)照) 7組DNA樣品 8組DNA樣品 9組DNA樣品 10組DNA樣品 UC19 HindⅢ UC19/ 樣量 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5，026 5，026 3，049 2，087 圖堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 泳道1與泳道9 加的樣品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8種超螺旋的質(zhì)粒DNA 構(gòu)成，DNA大小分別為:2，087 bp、3，049 bp、3，997 bp、5，026 bp、6，133 bp、8，023 bp、10，085 bp、11，849 bp。其中5，026 bp的條帶Z亮。 泳道2與泳道17加的樣品是pUC19質(zhì)粒。DNA，即超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA，其條帶在2.7kb左右，起對(duì)照作用。 泳道3與泳道16加的樣品是用HindⅢ酶切的pUC19質(zhì)粒。HindⅢ酶切pUC19的結(jié)果是使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的pUC19質(zhì)粒DNA的鏈斷裂成線狀的DNA， 線狀DNA電泳速率減慢。但是實(shí)驗(yàn)中所用的HindⅢ沒(méi)有將pUC19酶切充分，因此泳道3與泳道16電泳后會(huì)形成兩條條帶，其中暗帶是被HindⅢ酶切的pUC19 質(zhì)粒，明帶是沒(méi)有被HindⅢ酶切的pUC19質(zhì)粒。 泳道11是沒(méi)有加RNase的對(duì)照組的電泳圖像，由于RNA易形成各種高級(jí)結(jié)構(gòu)，同樣大小的DNA和RNA相比，RNA的電泳速率快。泳道11下方的大量明帶即為RNA電泳區(qū)域。 除了泳道15存在pUC19質(zhì)粒所在區(qū)域條帶，其他組的都無(wú)或無(wú)明顯的pUC19質(zhì)粒所在區(qū)域的條帶，包括泳道15在內(nèi)的所有組的條帶位置都偏低，因?yàn)閴A變性法有缺陷:容易導(dǎo)致不可逆的變性，不適合大質(zhì)粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就是不可逆的了，我們堿變性時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的變性不可逆，所以實(shí)際條帶位置和預(yù)估不一樣。 除了位置偏下的質(zhì)粒DNA帶以外，每一組都存在中間位置較弱的雜帶(實(shí)心箭頭所指)，我們推測(cè)此雜帶是沒(méi)有被沉淀的，在加了有機(jī)物后渦旋震蕩過(guò)程中所產(chǎn)生的線性染色體DNA的碎片，DNA，所以它的位置偏后。這一雜帶在泳道4、7、8、10、12和16尤為明顯。 個(gè)別組在加樣孔下方也存在較窄的DNA條帶(線性箭頭所指)，據(jù)推測(cè)，這種條帶的產(chǎn)生是質(zhì)粒DNA沉淀中少量染色體DNA雜質(zhì)的存在而產(chǎn)生的，由于染色體DNA片段過(guò)大，1%的瓊脂糖凝膠的分辨率有限，片段過(guò)大的DNA在電泳時(shí)速度極慢或很難穿過(guò)瓊脂糖凝膠的孔徑，因此，形成離上樣孔近的較窄的雜帶。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。 個(gè)別組在加樣孔處也存在較弱的DNA條帶(方形箭頭末端所指)，我們推測(cè)可能是沒(méi)有除盡的蛋白質(zhì)把加樣孔堵住了，導(dǎo)致少數(shù)DNA無(wú)法從加樣孔跑到凝膠當(dāng)中去。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。 我們組的質(zhì)粒DNA(0.124g)在泳道13，和其他泳道相比，我們的質(zhì)粒DNA的條帶稍微偏弱，這說(shuō)明我們?cè)诮M提取質(zhì)粒DNA時(shí)有一定的DNA損失，但是我們組的DNA碎片和染色體DNA雜帶也相對(duì)較弱，這可能和我們所提取的DNA量較少有關(guān)(和泳道4對(duì)照，由于此組提取的質(zhì)粒DNA量較大，所獲得的雜帶也較明顯。因此，不能因?yàn)槲覀兘M的雜帶少而確定我們組的結(jié)果好)，也有可能是我們的雜質(zhì)除去得較為充分(和泳道14相比，我們組的雜帶明亮程度和他們相近，但是我們的目標(biāo)帶明顯比他們亮度高)。 3.討論 加入5ml 溶液Ⅰ，渦旋的目的是重懸并洗滌菌體。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是為細(xì)胞提供等滲環(huán)境， Tris-HCl作為pH緩沖液，為細(xì)胞提供適宜酸堿環(huán)境，EDTA(pH 8.0時(shí)溶于水)是重要金屬螯合劑，可以與Mg2+、Ca2+等金屬絡(luò)合，YZDNase對(duì)DNA的降解作用。離心后盡可能去除干凈上清液，減少培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重懸并洗滌菌體。 加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，使分子去折疊，從而破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的。加入溶液Ⅰ后，溶液變得清亮粘稠，變得清亮是由于細(xì)胞破碎了，粘稠是由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等有機(jī)物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢顛倒，使之混勻，不能烈震蕩。震蕩過(guò)于劇烈會(huì)使染色體DNA斷裂成碎片，導(dǎo)致在質(zhì)粒DNA中引入雜質(zhì)。②NaOH的堿裂解作用和堿變性作用:NaOH可以與蛋白質(zhì)結(jié)合(細(xì)胞膜含有蛋白質(zhì))從而破碎細(xì)胞;在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，而質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。因此可通過(guò)之后對(duì)pH值的調(diào)節(jié)達(dá)到分離染色體DNA與質(zhì)粒DNA的目的。 此步驟等待時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)閺?qiáng)堿也會(huì)破壞質(zhì)粒DNA。 加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA太長(zhǎng)難以復(fù)性從而沉淀出來(lái)。不能復(fù)性的染色體DNA與

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