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  sijie199396 2017-05-17 00:00:00

  提取DNA主要有SDS和CTAB法，其實提取效果的好壞主要看提取的對象是什么樣的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在設計實驗步驟。 一）CTAB法 CTAB是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。 （二）SDS法 利用高濃度的SDS，在較高溫度（55—65℃）條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質及多糖雜質沉淀（Z常用的是加入5M的KAc于冰上保溫，在低溫條件下KAc與蛋白質及多糖結合成不溶物），離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 以下是在提取熱帶水果DNA時設計的兩種不同方法步驟，對比起來CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！ 1、 CTAB法 1） 在所需量的CTAB抽提液中加入2－巰基乙醇，使終濃度達2％（v/v）。將此溶液預熱至65℃。 對于每克新鮮的葉組織大約需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。 2） 用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷卻粉碎器/勻漿器，將0.5 g植物組織粉碎成細粉，然后將組織轉移到2.0 ml離心管。 3） 加入800 µl預熱的2－Me/CTAB，混合使之充分濕潤，于65℃溫育20 min，不時顛倒混勻。 4） 待冷至室溫后，加入800 µl氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻至溶液呈乳濁狀----但不要振蕩。25℃，10000 rpm離心10 min。 5） 上清（~700 µl）轉移至另一干凈的離心管中，加入5 µl RNaseA貯液，37℃溫育30 min。 6） 加入700 µl氯仿/異戊醇，顛倒混勻，25℃，10000 rpm離心10 min。 7） 上清（~600 µl）轉移至另一干凈的1.5 ml離心管中，加入600 µl異丙醇，顛倒混勻，室溫或-20℃放置20 min。 8） 25℃，12000 rpm，離心10 min，收集沉淀。 9） 去上清，加1 ml70%乙醇洗滌沉淀兩次。（25℃，12000 rpm，離心10 min） 10）涼干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存?zhèn)溆谩?2、 SDS法 ① 將0.3 g植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，將粉末轉至2 ml離心管中。 ② 加入1.2 ml預熱至65℃的提取緩沖液（其中加入3 μl β—巰基乙醇，增加DNA的穩(wěn)定性），置65℃水浴中放置30分鐘，不時顛倒混勻。。 ③ 加入0.45 ml 5M的醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘，在10000 rpm離心20 min。需要的話，Miracloth紗布過濾除去沉淀，上清液轉入另一離心管中。 ④ 加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000 rpm離心15 min。 ⑤ 轉移上清液到另一新離心管中，加5 μl RNaseA貯液，37℃溫育30 min。 ⑥ 加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000 rpm離心15 min。 ⑦ 轉移上清液到另一新離心管中，加入0.7V異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘沉淀核酸。 ⑧ 25℃，12000 rpm，離心10 min，收集沉淀。 ⑨ 棄上清，70％乙醇洗兩次。 ⑩ 涼干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存?zhèn)溆谩?/dd>

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