你想從Western Blot小白進(jìn)階到實(shí)驗(yàn)高手嗎？想了解Z先進(jìn)的數(shù)字PCR定量技術(shù)嗎？想了解新冠病毒數(shù)字PCR檢測(cè)方案嗎？想知道不一樣的正倒置一體熒光顯微鏡嗎？想了解實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理與分析方法嗎？你想知道的問題都在深藍(lán)云直播課堂。

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對(duì)于做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的科研人員來說，引物探針是一個(gè)無比熟悉的詞語(yǔ)。不管是普通的PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準(zhǔn)度更高的數(shù)字PCR（dPCR），高質(zhì)量的引物和探針都是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也并非那么容易。好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果千篇一律，不好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產(chǎn)物或者擴(kuò)增不出產(chǎn)物等等。從實(shí)驗(yàn)小白到大神，不斷地學(xué)習(xí)和摸索是少不了的。針對(duì)不同的PCR在引物和探針設(shè)計(jì)上又有哪些不同呢？如何評(píng)估設(shè)計(jì)的引物和探針的質(zhì)量呢？為了讓您少走彎路，深藍(lán)云直播間與您在線交流如何獲得更優(yōu)的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實(shí)驗(yàn)助一份力！

目前，越來越多的領(lǐng)域都會(huì)用到數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，但關(guān)于實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果評(píng)估缺少一個(gè)共識(shí)。在很多發(fā)表的文章中都缺乏足夠的dPCR實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，這樣不利于評(píng)審文章，甚至難以根據(jù)文章重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

為了讓大家更好地遵循MIQE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家依托于法國(guó)Stilla Technologies的Naica數(shù)字PCR平臺(tái)發(fā)布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)了乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并借此闡述了整個(gè)數(shù)字PCR操作流程以及如何運(yùn)用MIQE。

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PCR技術(shù)以特異性的寡核苷酸引物放大擴(kuò)增特定的DNA片段，一對(duì)引物在單次反應(yīng)擴(kuò)增單個(gè)基因。通常每個(gè)靶標(biāo)分別進(jìn)行檢測(cè)，即單重PCR反應(yīng)，但當(dāng)我們需要檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)基因時(shí)，單重PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力同時(shí)無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內(nèi)參基因的歸一化檢測(cè)，需要在同一反應(yīng)管中檢測(cè)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因，多重PCR實(shí)驗(yàn)無疑是最簡(jiǎn)單直接的解決方案。

多重PCR也稱復(fù)合PCR,是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種PCR擴(kuò)增技術(shù),即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（digital PCR）技術(shù)中，多重PCR設(shè)計(jì)配合多熒光通道可以進(jìn)行更多靶標(biāo)的相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)和直接的JD定量檢測(cè)，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時(shí)又比單重PCR更加GX、快捷和經(jīng)濟(jì)。

多重PCR實(shí)驗(yàn)具體如何進(jìn)行？又有哪些注意事項(xiàng)？實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR如何和多重PCR結(jié)合？北京深藍(lán)云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

想要了解更多關(guān)于單重PCR和多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相關(guān)信息，快來參加5月13號(hào)的直播課堂吧！

掃描二維碼進(jìn)入直播間

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結(jié)束，你需要驗(yàn)證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來檢測(cè)基因編輯嗎？快來參加本次深藍(lán)云直播課堂吧！

在之前發(fā)表的文章《實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，你選對(duì)了嗎?》中提到，實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應(yīng)用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長(zhǎng)。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關(guān)鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時(shí)會(huì)將其水解，從而釋放熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生信號(hào)。

TaqMan探針法的優(yōu)勢(shì)

?  高特異性，只有在探針和靶標(biāo)基因之間發(fā)生特異性的水解，才會(huì)生成熒光信號(hào)。

?  多重分析，可選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測(cè)多個(gè)不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設(shè)計(jì)原則

1. TaqMan探針的長(zhǎng)度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

引物探針設(shè)計(jì)不再犯愁

深藍(lán)云生物為您提供Gene-π網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物探針，可為您快速設(shè)計(jì)引物探針并進(jìn)行評(píng)估，復(fù)制鏈接可進(jìn)行查詢：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何選擇熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)

修飾基團(tuán)的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項(xiàng)：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團(tuán)，優(yōu)先選擇常用的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團(tuán)類型選擇淬滅基團(tuán)。早期的淬滅基團(tuán)TAMRA，自身會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，干擾檢測(cè)結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團(tuán)替代。目前淬滅基團(tuán)最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)時(shí)，每個(gè)通道要選擇不同的熒光基團(tuán)，且避免各標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

來自美國(guó)Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。

除此之外，Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)融合了高品質(zhì)Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，可為您的科學(xué)研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結(jié)果。

?   數(shù)據(jù)可靠性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致，溫控jingzhun，性能穩(wěn)定可靠。

?  應(yīng)用靈活性

提供多種qPCR應(yīng)用分析，定制化報(bào)告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   交互靈活性

主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網(wǎng)絡(luò)交互。

顯微鏡是由一個(gè)透鏡或幾個(gè)透鏡的組合構(gòu)成的一種光學(xué)儀器，是人類進(jìn)入原子時(shí)代的標(biāo)志。顯微鏡是人類最偉大的發(fā)明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長(zhǎng)期使用顯微鏡的小伙伴們，長(zhǎng)期觀察目鏡筒是否會(huì)感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發(fā)現(xiàn)時(shí)是否會(huì)困擾如何去跟別人描述新發(fā)現(xiàn)的位置？想要記錄視野圖像時(shí)是否需要反復(fù)的找合適角度拍照？

想要知道上面問題的解決辦法嗎？那就趕緊快來參加8月25日的深藍(lán)云直播課堂吧！您想知道的答案都在本次課程里，come on！

直播課

同學(xué)們又是做qPCR實(shí)驗(yàn)的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點(diǎn)開“analysis”的呢？點(diǎn)開之后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還靠譜嗎？現(xiàn)在讓小編來告訴你，qPCR實(shí)驗(yàn)的成功與否，關(guān)鍵在于各組數(shù)據(jù)是否達(dá)到判定標(biāo)準(zhǔn)以及是否符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，小小的qPCR實(shí)驗(yàn)它可以變得很簡(jiǎn)單，也可以變得很復(fù)雜，如何抓住qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵，是分析qPCR結(jié)果可信度的diyi步。

qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵

qPCR數(shù)據(jù)分析主要是利用Cq值進(jìn)行計(jì)算，所以我們需要了解qPCR反應(yīng)中幾個(gè)重要的參數(shù)，根據(jù)參數(shù)的表現(xiàn)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估：

擴(kuò)增曲線：圖1反映的是熒光信號(hào)變化量的對(duì)數(shù)與qPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系。圖2反映的是隨著qPCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短。標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號(hào)，然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）。

圖1：擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

圖2：擴(kuò)增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

基線：通常3-15個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)變化不大，變化趨勢(shì)接近于一條直線，即擴(kuò)增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。

閾值：是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動(dòng)設(shè)置是置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Cq值：qPCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時(shí)一般取Cq:15-35，太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

圖3：擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

評(píng)估qPCR反應(yīng)的效果

1、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。擴(kuò)增效率E在90-110%之間時(shí)，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況。

R2值：評(píng)估PCR效率的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它是說明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預(yù)測(cè)X值。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值大于0.98時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

2、重復(fù)性

重復(fù)性即是指精確度，反映多次測(cè)量值之間的接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就?。蝗绻S多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。例如，假設(shè)PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Cq間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250?？偟膩碚f，重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

圖5：8個(gè)重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

3、重現(xiàn)性

指不同批次之間或不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR結(jié)果的變化，通常表示為拷貝數(shù)或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺(tái)獨(dú)立的Azure Cielo 儀器上檢測(cè)GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個(gè)樣本中可通過實(shí)驗(yàn)精確測(cè)量的最小拷貝數(shù)，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測(cè)確定為陽(yáng)性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測(cè)得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定ZD檢測(cè)限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導(dǎo)致的。假設(shè)符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測(cè)到1個(gè)拷貝。

圖7：5個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

5、準(zhǔn)確度

反映測(cè)量值和真實(shí)值的接近程度，以倍數(shù)變化或拷貝數(shù)進(jìn)行估算。

6、特異性

指qPCR實(shí)驗(yàn)中只可以檢測(cè)到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會(huì)擴(kuò)增其他基因序列?？赏ㄟ^凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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Azure  Cielo?性能展示

?   高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復(fù)性

重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線高度重合

96孔重復(fù)結(jié)果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數(shù)（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準(zhǔn)確區(qū)分2倍濃度差異樣品

人內(nèi)參cDNA（GAPDH）進(jìn)行10個(gè)梯度，

2倍稀釋，3個(gè)重復(fù)，線性擬合度

R2=0.998，擴(kuò)增效率E=99.89%

TaqMan探針法因其良好的特異性以及可多重檢測(cè)而受到實(shí)驗(yàn)人員的青睞，其實(shí)除了探針法外，還有很多好的實(shí)驗(yàn)方法也被實(shí)驗(yàn)人員廣泛認(rèn)可，這次就介紹一下另一個(gè)應(yīng)用廣泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因?yàn)槟男﹥?yōu)點(diǎn)獲得實(shí)驗(yàn)人員的青睞呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，其不會(huì)與單鏈DNA結(jié)合，且在游離狀態(tài)下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結(jié)合才會(huì)發(fā)出熒光，因此將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的效果。

SYBR Green染料法優(yōu)點(diǎn)

?  通用性好，適合進(jìn)行大多數(shù)類型的定量反應(yīng)，可以進(jìn)行熔解曲線的分析。

?  無需設(shè)計(jì)探針，引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，不用考慮基團(tuán)選擇，易于上手；成本低，無需合成探針。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

SYBR Green染料法缺點(diǎn)

SYBR Green染料法也有其缺點(diǎn)，SYBR Green染料法一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)基因，無法進(jìn)行二重甚至多重的實(shí)驗(yàn)。同樣的相對(duì)于TaqMan探針法其特異性較差，當(dāng)引物存在二聚體或者非特異性擴(kuò)增時(shí)，染料同樣可以結(jié)合并發(fā)出熒光，影響定量結(jié)果。因此對(duì)于SYBR Green染料法而言，設(shè)計(jì)一套好用的引物是重中之重。

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設(shè)計(jì)好引物后，我們?cè)撛趺催M(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/b>

1.實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

我們需要對(duì)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效果進(jìn)行分析，使用陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，且大小符合設(shè)計(jì)預(yù)期，如有條件可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，保證準(zhǔn)確性。當(dāng)引物無問題后，進(jìn)行反應(yīng)條件的探索，對(duì)退火溫度進(jìn)行溫度梯度檢測(cè)，找到合適的退火溫度，即PCR擴(kuò)增效果好，陰性模板無擴(kuò)增，條帶單一，熔解曲線單峰等。

2.預(yù)實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)好引物并探索好實(shí)驗(yàn)條件后，對(duì)樣本進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)將樣本進(jìn)行梯度稀釋用以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析內(nèi)參基因以及目的基因的擴(kuò)增效率是否接近且在100%左右，其次可確認(rèn)高濃度模板中是否有yizhi劑干擾，從而確定實(shí)驗(yàn)時(shí)合適的模板濃度（樣本是否需要稀釋或濃縮）。

3.正式實(shí)驗(yàn)

當(dāng)我們完成了實(shí)驗(yàn)條件和預(yù)實(shí)驗(yàn)后就可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)了，每個(gè)樣品都需要3個(gè)或以上的重復(fù)，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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