PCR技術(shù)以特異性的寡核苷酸引物放大擴(kuò)增特定的DNA片段，一對引物在單次反應(yīng)擴(kuò)增單個(gè)基因。通常每個(gè)靶標(biāo)分別進(jìn)行檢測，即單重PCR反應(yīng)，但當(dāng)我們需要檢測多個(gè)靶標(biāo)基因時(shí)，單重PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力同時(shí)無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內(nèi)參基因的歸一化檢測，需要在同一反應(yīng)管中檢測內(nèi)參基因和目標(biāo)基因，多重PCR實(shí)驗(yàn)無疑是最簡單直接的解決方案。

多重PCR也稱復(fù)合PCR,是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種PCR擴(kuò)增技術(shù),即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（digital PCR）技術(shù)中，多重PCR設(shè)計(jì)配合多熒光通道可以進(jìn)行更多靶標(biāo)的相對于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測和直接的JD定量檢測，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時(shí)又比單重PCR更加GX、快捷和經(jīng)濟(jì)。

多重PCR實(shí)驗(yàn)具體如何進(jìn)行？又有哪些注意事項(xiàng)？實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR如何和多重PCR結(jié)合？北京深藍(lán)云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

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目前，越來越多的領(lǐng)域都會用到數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，但關(guān)于實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果評估缺少一個(gè)共識。在很多發(fā)表的文章中都缺乏足夠的dPCR實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，這樣不利于評審文章，甚至難以根據(jù)文章重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

為了讓大家更好地遵循MIQE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家依托于法國Stilla Technologies的Naica數(shù)字PCR平臺發(fā)布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數(shù)字PCR技術(shù)檢測了乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并借此闡述了整個(gè)數(shù)字PCR操作流程以及如何運(yùn)用MIQE。

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基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結(jié)束，你需要驗(yàn)證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍(lán)云直播課堂吧！

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為分子生物學(xué)研究不可或缺的一種技術(shù)手段，常見應(yīng)用于基因表達(dá)分析、腫瘤疾病診斷、病原微生物檢測、食品安全分析和動(dòng)植物育種等。qPCR檢測技術(shù)由于具有高靈敏度的特性，應(yīng)盡量避免操作中的實(shí)驗(yàn)誤差，確保獲得可靠真實(shí)的數(shù)據(jù)。那么如何確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和真實(shí)性，則需要通過對qPCR關(guān)鍵數(shù)據(jù)的評估來進(jìn)行判斷。除此之外，如何分析qPCR異常數(shù)據(jù)，也是每一位qPCR實(shí)驗(yàn)者需要經(jīng)歷的必要環(huán)節(jié)。

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直 播 課 

對于做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的科研人員來說，引物探針是一個(gè)無比熟悉的詞語。不管是普通的PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準(zhǔn)度更高的數(shù)字PCR（dPCR），高質(zhì)量的引物和探針都是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也并非那么容易。好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果千篇一律，不好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產(chǎn)物或者擴(kuò)增不出產(chǎn)物等等。從實(shí)驗(yàn)小白到大神，不斷地學(xué)習(xí)和摸索是少不了的。針對不同的PCR在引物和探針設(shè)計(jì)上又有哪些不同呢？如何評估設(shè)計(jì)的引物和探針的質(zhì)量呢？為了讓您少走彎路，深藍(lán)云直播間與您在線交流如何獲得更優(yōu)的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實(shí)驗(yàn)助一份力！

第三代PCR技術(shù)即數(shù)字PCR（digtal PCR）技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對起始樣品核酸的定量。在反應(yīng)體系中加入熒光染料的同時(shí)將反應(yīng)體系進(jìn)行分區(qū)，實(shí)現(xiàn)單分子模板擴(kuò)增，Z后通過陽性反應(yīng)器數(shù)直接讀出目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，可以對低拷貝基因進(jìn)行檢測，彌補(bǔ)了熒光PCR的不足。因其出色的靈敏度和精確度，數(shù)字PCR在檢測微量核酸樣本，稀有突變，拷貝數(shù)變異，復(fù)雜樣品檢測等方面均有廣泛的應(yīng)用前景。

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數(shù)字PCR課堂

為了方便大家更好的學(xué)習(xí)數(shù)字PCR技術(shù)，由法國Stilla Technologies公司開發(fā)的Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂為您全方位解讀數(shù)字PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)從新手到專家的進(jìn)階，適用于所有對數(shù)字PCR技術(shù)感興趣的科學(xué)家。該平臺為用戶提供Z新的數(shù)字PCR技術(shù)信息，使用戶能夠?qū)W習(xí)數(shù)字PCR技術(shù)的基本知識。詳細(xì)信息可登陸網(wǎng)站或掃描二維碼查看。

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在之前發(fā)表的文章《實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，你選對了嗎?》中提到，實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應(yīng)用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關(guān)鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時(shí)會將其水解，從而釋放熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生信號。

TaqMan探針法的優(yōu)勢

?  高特異性，只有在探針和靶標(biāo)基因之間發(fā)生特異性的水解，才會生成熒光信號。

?  多重分析，可選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測多個(gè)不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設(shè)計(jì)原則

1. TaqMan探針的長度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

引物探針設(shè)計(jì)不再犯愁

深藍(lán)云生物為您提供Gene-π網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物探針，可為您快速設(shè)計(jì)引物探針并進(jìn)行評估，復(fù)制鏈接可進(jìn)行查詢：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何選擇熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)

修飾基團(tuán)的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項(xiàng)：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團(tuán)，優(yōu)先選擇常用的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團(tuán)類型選擇淬滅基團(tuán)。早期的淬滅基團(tuán)TAMRA，自身會發(fā)出熒光信號，干擾檢測結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團(tuán)替代。目前淬滅基團(tuán)最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進(jìn)行多重qPCR檢測時(shí)，每個(gè)通道要選擇不同的熒光基團(tuán)，且避免各標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。

除此之外，Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)融合了高品質(zhì)Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)，可為您的科學(xué)研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結(jié)果。

?   數(shù)據(jù)可靠性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致，溫控jingzhun，性能穩(wěn)定可靠。

?  應(yīng)用靈活性

提供多種qPCR應(yīng)用分析，定制化報(bào)告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   交互靈活性

主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網(wǎng)絡(luò)交互。

生物通“2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品評選”活動(dòng)自啟動(dòng)以來，受到了各界廣泛的關(guān)注。經(jīng)過一個(gè)月的投票和專家評鑒，2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品現(xiàn)已揭曉。這些產(chǎn)品或助力新冠病毒的檢測，或從新的角度揭開生物學(xué)的復(fù)雜機(jī)制，有望推動(dòng)基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化。

在同類型的產(chǎn)品中，經(jīng)過層層篩選，深藍(lán)云生物的新品：naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，在同類產(chǎn)品中脫穎而出，獲得2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品大獎(jiǎng)。

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度，融合傳統(tǒng)微滴式和芯片式優(yōu)勢，被稱為下一代數(shù)字PCR技術(shù)。

2021年4月13日，深藍(lán)云Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂——數(shù)字PCR病毒載量檢測工具（北京站）在國家疾控ZX成功舉辦。為更好的服務(wù)于用戶，本次培訓(xùn)班以理論結(jié)合實(shí)踐的形式，聚焦數(shù)字PCR原理系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析，病毒載量檢測等核心內(nèi)容，受到了用戶的一致好評。

數(shù)字PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展為核酸定量和核酸檢測提供了全新的思路。無需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可提供比qPCR的核酸定量，直接讀取陽性信號，通過泊松分布校正得到目標(biāo)基因的JD拷貝數(shù)，并具有高靈敏度等特點(diǎn)。

本次訓(xùn)練營對第三代數(shù)字PCR技術(shù)及naica??微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)介紹、naica??數(shù)字PCR核酸JD定量技術(shù)中的病原體檢測應(yīng)用、病毒載體JD拷貝濃度數(shù)字PCR檢測實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、特別是一步法數(shù)字PCR新冠病毒檢測試劑盒的使用和結(jié)果判讀等方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，同時(shí)進(jìn)行實(shí)操。

▲ 專家在進(jìn)行精彩的分享

▲ 實(shí)驗(yàn)操作

作為數(shù)字PCR頭部企業(yè)技術(shù)開創(chuàng)者的法國Stilla Technologies公司于2019年提出數(shù)字PCR在線學(xué)習(xí)資源ZXgene-π學(xué)堂，為使用和即將使用數(shù)字PCR技術(shù)的專家學(xué)者提供有效的途徑，同時(shí)開展Gene-π數(shù)字PCR線下實(shí)操培訓(xùn)課堂，為用戶提供完善的服務(wù)以及優(yōu)化的應(yīng)用解決方案。

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，以Sapphire芯片（全自動(dòng)）或Opal（高通量）芯片為耗材，形成25,000-30,000個(gè)微滴的2D陣列，以單層平鋪方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)完成后對微滴進(jìn)行三色通道或六色通道檢測，從而對起始核酸濃度進(jìn)行JD定量。2.5小時(shí)內(nèi)，可快速獲得結(jié)果。

     核酸提取耗材/PCR管/PCR板系列/PCR單管本生（天津）健康科技有限公司供應(yīng)：移液器吸嘴，ELISA試劑盒，動(dòng)物血清，全系熒光定量PCR耗材，產(chǎn)品包括：PCR單管、八聯(lián)管、96孔板、384孔板。

　　PCR耗材容量有0.1ml和0.2ml兩種，顏色有透明和白色兩種，型號有單管、8聯(lián)管、12聯(lián)管，適用普通PCR和qPCR反應(yīng)

　　【產(chǎn)品特點(diǎn)】

　　無DNA酶和RNA酶，無DNA和RNA

　　精度模具充分管壁超薄均勻及產(chǎn)品的均一性，并具備的熱傳導(dǎo)效應(yīng)，使管內(nèi)反應(yīng)液以最快的速度達(dá)到目標(biāo)溫度，促進(jìn)樣品擴(kuò)增

　　15.4mm矮管設(shè)計(jì)降低由冷凝液造成的污染，錐形管的凸邊設(shè)計(jì)有效地密封性，預(yù)防交叉污染

　　材料和處理工藝制造，平蓋光損極低，適用于熒光定量PCR

　　無熱解析出物，無內(nèi)毒素

　　適用于大多數(shù)自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)儀器

　　有方向孔，易于辨別方向

　　核酸提取耗材/PCR管/PCR板系列/PCR單管本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

顯微鏡是由一個(gè)透鏡或幾個(gè)透鏡的組合構(gòu)成的一種光學(xué)儀器，是人類進(jìn)入原子時(shí)代的標(biāo)志。顯微鏡是人類最偉大的發(fā)明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長期使用顯微鏡的小伙伴們，長期觀察目鏡筒是否會感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發(fā)現(xiàn)時(shí)是否會困擾如何去跟別人描述新發(fā)現(xiàn)的位置？想要記錄視野圖像時(shí)是否需要反復(fù)的找合適角度拍照？

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