第三代PCR技術(shù)即數(shù)字PCR（digtal PCR）技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣品核酸的定量。在反應(yīng)體系中加入熒光染料的同時(shí)將反應(yīng)體系進(jìn)行分區(qū)，實(shí)現(xiàn)單分子模板擴(kuò)增，Z后通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)器數(shù)直接讀出目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，可以對(duì)低拷貝基因進(jìn)行檢測(cè)，彌補(bǔ)了熒光PCR的不足。因其出色的靈敏度和精確度，數(shù)字PCR在檢測(cè)微量核酸樣本，稀有突變，拷貝數(shù)變異，復(fù)雜樣品檢測(cè)等方面均有廣泛的應(yīng)用前景。

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數(shù)字PCR課堂

為了方便大家更好的學(xué)習(xí)數(shù)字PCR技術(shù)，由法國(guó)Stilla Technologies公司開發(fā)的Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂為您全方位解讀數(shù)字PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)從新手到專家的進(jìn)階，適用于所有對(duì)數(shù)字PCR技術(shù)感興趣的科學(xué)家。該平臺(tái)為用戶提供Z新的數(shù)字PCR技術(shù)信息，使用戶能夠?qū)W習(xí)數(shù)字PCR技術(shù)的基本知識(shí)。詳細(xì)信息可登陸網(wǎng)站或掃描二維碼查看。

除了數(shù)字PCR，還有Western Blot解決方案打卡送書供大家學(xué)習(xí)，點(diǎn)擊鏈接：http://www.cycloudbio.com/product/38404.html 報(bào)名參加吧。

目前，越來(lái)越多的領(lǐng)域都會(huì)用到數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，但關(guān)于實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果評(píng)估缺少一個(gè)共識(shí)。在很多發(fā)表的文章中都缺乏足夠的dPCR實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，這樣不利于評(píng)審文章，甚至難以根據(jù)文章重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

為了讓大家更好地遵循MIQE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家依托于法國(guó)Stilla Technologies的Naica數(shù)字PCR平臺(tái)發(fā)布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過(guò)6色熒光數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)了乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并借此闡述了整個(gè)數(shù)字PCR操作流程以及如何運(yùn)用MIQE。

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你想從Western Blot小白進(jìn)階到實(shí)驗(yàn)高手嗎？想了解Z先進(jìn)的數(shù)字PCR定量技術(shù)嗎？想了解新冠病毒數(shù)字PCR檢測(cè)方案嗎？想知道不一樣的正倒置一體熒光顯微鏡嗎？想了解實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理與分析方法嗎？你想知道的問(wèn)題都在深藍(lán)云直播課堂。

有些朋友說(shuō)因時(shí)間關(guān)系，沒能趕上直播講座，沒關(guān)系， 小編為您雙手奉上精彩的直播視頻分享~

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生物通“2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品評(píng)選”活動(dòng)自啟動(dòng)以來(lái)，受到了各界廣泛的關(guān)注。經(jīng)過(guò)一個(gè)月的投票和專家評(píng)鑒，2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品現(xiàn)已揭曉。這些產(chǎn)品或助力新冠病毒的檢測(cè)，或從新的角度揭開生物學(xué)的復(fù)雜機(jī)制，有望推動(dòng)基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化。

在同類型的產(chǎn)品中，經(jīng)過(guò)層層篩選，深藍(lán)云生物的新品：naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，在同類產(chǎn)品中脫穎而出，獲得2020生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品大獎(jiǎng)。

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度，融合傳統(tǒng)微滴式和芯片式優(yōu)勢(shì)，被稱為下一代數(shù)字PCR技術(shù)。

2021年4月13日，深藍(lán)云Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂——數(shù)字PCR病毒載量檢測(cè)工具（北京站）在國(guó)家疾控ZX成功舉辦。為更好的服務(wù)于用戶，本次培訓(xùn)班以理論結(jié)合實(shí)踐的形式，聚焦數(shù)字PCR原理系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析，病毒載量檢測(cè)等核心內(nèi)容，受到了用戶的一致好評(píng)。

數(shù)字PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展為核酸定量和核酸檢測(cè)提供了全新的思路。無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可提供比qPCR的核酸定量，直接讀取陽(yáng)性信號(hào)，通過(guò)泊松分布校正得到目標(biāo)基因的JD拷貝數(shù)，并具有高靈敏度等特點(diǎn)。

本次訓(xùn)練營(yíng)對(duì)第三代數(shù)字PCR技術(shù)及naica??微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)介紹、naica??數(shù)字PCR核酸JD定量技術(shù)中的病原體檢測(cè)應(yīng)用、病毒載體JD拷貝濃度數(shù)字PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、特別是一步法數(shù)字PCR新冠病毒檢測(cè)試劑盒的使用和結(jié)果判讀等方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，同時(shí)進(jìn)行實(shí)操。

▲ 專家在進(jìn)行精彩的分享

▲ 實(shí)驗(yàn)操作

作為數(shù)字PCR頭部企業(yè)技術(shù)開創(chuàng)者的法國(guó)Stilla Technologies公司于2019年提出數(shù)字PCR在線學(xué)習(xí)資源ZXgene-π學(xué)堂，為使用和即將使用數(shù)字PCR技術(shù)的專家學(xué)者提供有效的途徑，同時(shí)開展Gene-π數(shù)字PCR線下實(shí)操培訓(xùn)課堂，為用戶提供完善的服務(wù)以及優(yōu)化的應(yīng)用解決方案。

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，以Sapphire芯片（全自動(dòng)）或Opal（高通量）芯片為耗材，形成25,000-30,000個(gè)微滴的2D陣列，以單層平鋪方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)完成后對(duì)微滴進(jìn)行三色通道或六色通道檢測(cè)，從而對(duì)起始核酸濃度進(jìn)行JD定量。2.5小時(shí)內(nèi)，可快速獲得結(jié)果。

PCR技術(shù)以特異性的寡核苷酸引物放大擴(kuò)增特定的DNA片段，一對(duì)引物在單次反應(yīng)擴(kuò)增單個(gè)基因。通常每個(gè)靶標(biāo)分別進(jìn)行檢測(cè)，即單重PCR反應(yīng)，但當(dāng)我們需要檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)基因時(shí)，單重PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力同時(shí)無(wú)法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內(nèi)參基因的歸一化檢測(cè)，需要在同一反應(yīng)管中檢測(cè)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因，多重PCR實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是最簡(jiǎn)單直接的解決方案。

多重PCR也稱復(fù)合PCR,是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種PCR擴(kuò)增技術(shù),即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（digital PCR）技術(shù)中，多重PCR設(shè)計(jì)配合多熒光通道可以進(jìn)行更多靶標(biāo)的相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)和直接的JD定量檢測(cè)，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時(shí)又比單重PCR更加GX、快捷和經(jīng)濟(jì)。

多重PCR實(shí)驗(yàn)具體如何進(jìn)行？又有哪些注意事項(xiàng)？實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR如何和多重PCR結(jié)合？北京深藍(lán)云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

想要了解更多關(guān)于單重PCR和多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相關(guān)信息，快來(lái)參加5月13號(hào)的直播課堂吧！

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你想知道現(xiàn)在期刊雜志對(duì)WB數(shù)據(jù)提交的要求嗎？想知道熒光Western與化學(xué)發(fā)光的不同嗎？想知道如何進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控嗎？想知道用什么內(nèi)參Z合理嗎？想知道定量WB如何做嗎？想知道WB常見問(wèn)題如何解決嗎？你想知道的問(wèn)題都在這里，快來(lái)參加深藍(lán)云知識(shí)打卡，每一關(guān)都有您關(guān)注的ZD，既能得到WB應(yīng)用指南，還有小禮品贈(zèng)送哦。

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2021年5月13日，深藍(lán)云Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂——核酸JD定量分析及應(yīng)用訓(xùn)練營(yíng)（北京站）在北大YL創(chuàng)新谷成功舉辦。本次培訓(xùn)以理論結(jié)合實(shí)踐的形式，聚焦數(shù)字PCR原理系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析，在先進(jìn)ZL中數(shù)字PCR技術(shù)的體系開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的JD定量等核心內(nèi)容，受到學(xué)員的一致好評(píng)。

數(shù)字PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展為核酸定量和基因檢測(cè)提供了全新的思路，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞/單分子層面的JD定量。目前，該技術(shù)已經(jīng)在腫瘤個(gè)體化診療、基因編輯、液體活檢、病原微生物、先進(jìn)的細(xì)胞ZL、基因ZL檢測(cè)等前沿生命科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)突破性應(yīng)用和發(fā)展。

本次訓(xùn)練營(yíng)對(duì)第三代數(shù)字PCR技術(shù)及naica??微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)介紹、naica?? 微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在核酸JD定量技術(shù)及先進(jìn)ZL中的應(yīng)用、在生物制品安全檢測(cè)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，同時(shí)進(jìn)行實(shí)操。

▲ 專家在進(jìn)行精彩的分享

▲ 實(shí)驗(yàn)操作

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為了更好的服務(wù)用戶，及時(shí)響應(yīng)用戶需求，回饋和泰純水用戶的信任與支持，和泰在2016~2017年度分別舉辦了兩季“注冊(cè)保修卡，砸蛋拿好禮”活動(dòng)。

凡是新購(gòu)機(jī)用戶，注冊(cè)產(chǎn)品保修卡后，均可參與活動(dòng)。

只要您來(lái)砸，就有禮品送！

我們?cè)诨仞伝堇脩舻耐瑫r(shí)，也將根據(jù)注冊(cè)信息，提供及時(shí)全面的售后服務(wù)保證！

2018年，我們對(duì)此活動(dòng)進(jìn)行了優(yōu)化和升級(jí)，第三季活動(dòng)正式開啟啦！

如果您想得到全面的售后服務(wù)保障，購(gòu)買純水產(chǎn)品后，切記要注冊(cè)保修卡?。?/p>

注冊(cè)方式 

1. 紙質(zhì)注冊(cè)

機(jī)器包裝箱內(nèi)附帶保修卡，填寫好后拍照發(fā)送至：“和泰微信”即可

2. 注冊(cè)

進(jìn)入網(wǎng)址：http://www.high-tech。。ｃｎ/baoka.html，填寫信息

3. 微信注冊(cè)

和泰微信公眾號(hào)-便捷服務(wù)-保修卡注冊(cè)，填寫信息

注冊(cè)完成后，即可參與活動(dòng)啦！

活動(dòng)入口：

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活動(dòng)獎(jiǎng)品：

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即有售后權(quán)益保障，又有貼心禮品相送，

如此良心惠利的活動(dòng)，

還在猶豫什么，

即刻注冊(cè)起來(lái)吧！

2021年4月7日，深藍(lán)云Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂——先進(jìn)ZL中核酸定量分析及應(yīng)用（上海張江站）成功舉辦。本次訓(xùn)練營(yíng)以理論結(jié)合實(shí)踐的形式，聚焦于數(shù)字PCR原理系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)操作、應(yīng)用進(jìn)展、結(jié)果分析，先進(jìn)ZL中的質(zhì)量控制、病毒載體標(biāo)準(zhǔn)品定量等核心內(nèi)容，受到了學(xué)員們的一致好評(píng)。

數(shù)字PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展為核酸定量和基因檢測(cè)提供了全新的思路，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞/單分子層面的JD定量。目前，該技術(shù)已經(jīng)在腫瘤個(gè)體化診療、基因編輯、液體活檢、病原微生物、先進(jìn)ZL檢測(cè)等前沿生命科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)突破性應(yīng)用和發(fā)展。

為了更好地讓廣大臨床、科研工作者了解數(shù)字PCR技術(shù)，本次訓(xùn)練營(yíng)對(duì)第三代數(shù)字PCR技術(shù)及naica??微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)介紹、數(shù)字PCR系統(tǒng)原理、naica??數(shù)字PCR核酸JD定量技術(shù)及先進(jìn)ZL中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，同時(shí)進(jìn)行實(shí)操。

▲ 專家在進(jìn)行精彩的分享

▲ 實(shí)驗(yàn)操作

數(shù)字PCR技術(shù)的誕生和發(fā)展為核酸JZ定量與基因檢測(cè)提供了全新的思路，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，尤其以醫(yī)學(xué)方面為最， 在先進(jìn)ZL（Advanced Therapy）如細(xì)胞ZL、基因ZL、免疫ZL等研究中，質(zhì)控體系至關(guān)重要，目標(biāo)核酸的JD定量有助于直觀有效的量化指標(biāo)，受到了學(xué)員們的一致認(rèn)可。

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為分子生物學(xué)研究不可或缺的一種技術(shù)手段，常見應(yīng)用于基因表達(dá)分析、腫瘤疾病診斷、病原微生物檢測(cè)、食品安全分析和動(dòng)植物育種等。qPCR檢測(cè)技術(shù)由于具有高靈敏度的特性，應(yīng)盡量避免操作中的實(shí)驗(yàn)誤差，確保獲得可靠真實(shí)的數(shù)據(jù)。那么如何確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和真實(shí)性，則需要通過(guò)對(duì)qPCR關(guān)鍵數(shù)據(jù)的評(píng)估來(lái)進(jìn)行判斷。除此之外，如何分析qPCR異常數(shù)據(jù)，也是每一位qPCR實(shí)驗(yàn)者需要經(jīng)歷的必要環(huán)節(jié)。

北京深藍(lán)云生物科技有限公司為您答疑解惑，提供 “實(shí)時(shí)熒光定量PCR的關(guān)鍵數(shù)據(jù)及常見問(wèn)題分析” 網(wǎng)絡(luò)直播課。

想了解更多關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR知識(shí)的分享，快來(lái)參加深藍(lán)云直播課堂吧！

直 播 課 

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結(jié)束，你需要驗(yàn)證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因編輯嗎？快來(lái)參加本次深藍(lán)云直播課堂吧！

在之前發(fā)表的文章《實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，你選對(duì)了嗎?》中提到，實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應(yīng)用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長(zhǎng)。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關(guān)鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時(shí)會(huì)將其水解，從而釋放熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生信號(hào)。

TaqMan探針法的優(yōu)勢(shì)

?  高特異性，只有在探針和靶標(biāo)基因之間發(fā)生特異性的水解，才會(huì)生成熒光信號(hào)。

?  多重分析，可選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測(cè)多個(gè)不同的序列。

?  無(wú)需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設(shè)計(jì)原則

1. TaqMan探針的長(zhǎng)度zuihao不超過(guò)30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過(guò)程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個(gè)或超過(guò)4個(gè)的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

引物探針設(shè)計(jì)不再犯愁

深藍(lán)云生物為您提供Gene-π網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物探針，可為您快速設(shè)計(jì)引物探針并進(jìn)行評(píng)估，復(fù)制鏈接可進(jìn)行查詢：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何選擇熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)

修飾基團(tuán)的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項(xiàng)：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團(tuán)，優(yōu)先選擇常用的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團(tuán)類型選擇淬滅基團(tuán)。早期的淬滅基團(tuán)TAMRA，自身會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，干擾檢測(cè)結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團(tuán)替代。目前淬滅基團(tuán)最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)時(shí)，每個(gè)通道要選擇不同的熒光基團(tuán)，且避免各標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

來(lái)自美國(guó)Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。

除此之外，Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)融合了高品質(zhì)Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，可為您的科學(xué)研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結(jié)果。

?   數(shù)據(jù)可靠性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致，溫控jingzhun，性能穩(wěn)定可靠。

?  應(yīng)用靈活性

提供多種qPCR應(yīng)用分析，定制化報(bào)告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   交互靈活性

主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網(wǎng)絡(luò)交互。

顯微鏡是由一個(gè)透鏡或幾個(gè)透鏡的組合構(gòu)成的一種光學(xué)儀器，是人類進(jìn)入原子時(shí)代的標(biāo)志。顯微鏡是人類最偉大的發(fā)明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長(zhǎng)期使用顯微鏡的小伙伴們，長(zhǎng)期觀察目鏡筒是否會(huì)感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發(fā)現(xiàn)時(shí)是否會(huì)困擾如何去跟別人描述新發(fā)現(xiàn)的位置？想要記錄視野圖像時(shí)是否需要反復(fù)的找合適角度拍照？

想要知道上面問(wèn)題的解決辦法嗎？那就趕緊快來(lái)參加8月25日的深藍(lán)云直播課堂吧！您想知道的答案都在本次課程里，come on！

直播課

2020年已經(jīng)過(guò)去了三分之二

經(jīng)歷了疫情的考驗(yàn)

不少高校也陸續(xù)開學(xué)了

今年的寒假格外漫長(zhǎng)

一直放到暑假結(jié)束

開學(xué)季來(lái)臨

相信大家都已經(jīng)開始籌備實(shí)驗(yàn)課題了

別忘了還有一件很重要的事情

你該準(zhǔn)備試劑耗材啦！

同學(xué)們又是做qPCR實(shí)驗(yàn)的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點(diǎn)開“analysis”的呢？點(diǎn)開之后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線不正常，或者Cq值過(guò)大，又或者SD值太高，那這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還靠譜嗎？現(xiàn)在讓小編來(lái)告訴你，qPCR實(shí)驗(yàn)的成功與否，關(guān)鍵在于各組數(shù)據(jù)是否達(dá)到判定標(biāo)準(zhǔn)以及是否符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，小小的qPCR實(shí)驗(yàn)它可以變得很簡(jiǎn)單，也可以變得很復(fù)雜，如何抓住qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵，是分析qPCR結(jié)果可信度的diyi步。

qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵

qPCR數(shù)據(jù)分析主要是利用Cq值進(jìn)行計(jì)算，所以我們需要了解qPCR反應(yīng)中幾個(gè)重要的參數(shù)，根據(jù)參數(shù)的表現(xiàn)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估：

擴(kuò)增曲線：圖1反映的是熒光信號(hào)變化量的對(duì)數(shù)與qPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系。圖2反映的是隨著qPCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短。標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號(hào)，然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）。

圖1：擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

圖2：擴(kuò)增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

基線：通常3-15個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)變化不大，變化趨勢(shì)接近于一條直線，即擴(kuò)增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。

閾值：是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過(guò)閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動(dòng)設(shè)置是置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Cq值：qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時(shí)一般取Cq:15-35，太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

圖3：擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

評(píng)估qPCR反應(yīng)的效果

1、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。擴(kuò)增效率E在90-110%之間時(shí)，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況。

R2值：評(píng)估PCR效率的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它是說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過(guò)Y值來(lái)預(yù)測(cè)X值。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值大于0.98時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

2、重復(fù)性

重復(fù)性即是指精確度，反映多次測(cè)量值之間的接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。例如，假設(shè)PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Cq間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250。總的來(lái)說(shuō)，重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

圖5：8個(gè)重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

3、重現(xiàn)性

指不同批次之間或不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR結(jié)果的變化，通常表示為拷貝數(shù)或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺(tái)獨(dú)立的Azure Cielo 儀器上檢測(cè)GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個(gè)樣本中可通過(guò)實(shí)驗(yàn)精確測(cè)量的最小拷貝數(shù)，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測(cè)確定為陽(yáng)性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測(cè)得到的濃度，可通過(guò)梯度稀釋樣品來(lái)確定ZD檢測(cè)限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導(dǎo)致的。假設(shè)符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測(cè)到1個(gè)拷貝。

圖7：5個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

5、準(zhǔn)確度

反映測(cè)量值和真實(shí)值的接近程度，以倍數(shù)變化或拷貝數(shù)進(jìn)行估算。

6、特異性

指qPCR實(shí)驗(yàn)中只可以檢測(cè)到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會(huì)擴(kuò)增其他基因序列。可通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過(guò)qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來(lái)判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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Azure  Cielo?性能展示

?   高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復(fù)性

重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線高度重合

96孔重復(fù)結(jié)果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數(shù)（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準(zhǔn)確區(qū)分2倍濃度差異樣品

人內(nèi)參cDNA（GAPDH）進(jìn)行10個(gè)梯度，

2倍稀釋，3個(gè)重復(fù)，線性擬合度

R2=0.998，擴(kuò)增效率E=99.89%