在之前發(fā)表的文章《實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，你選對了嗎?》中提到，實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應(yīng)用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關(guān)鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時(shí)會(huì)將其水解，從而釋放熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生信號。

TaqMan探針法的優(yōu)勢

?  高特異性，只有在探針和靶標(biāo)基因之間發(fā)生特異性的水解，才會(huì)生成熒光信號。

?  多重分析，可選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測多個(gè)不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設(shè)計(jì)原則

1. TaqMan探針的長度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

引物探針設(shè)計(jì)不再犯愁

深藍(lán)云生物為您提供Gene-π網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物探針，可為您快速設(shè)計(jì)引物探針并進(jìn)行評估，復(fù)制鏈接可進(jìn)行查詢：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何選擇熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)

修飾基團(tuán)的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項(xiàng)：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團(tuán)，優(yōu)先選擇常用的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團(tuán)類型選擇淬滅基團(tuán)。早期的淬滅基團(tuán)TAMRA，自身會(huì)發(fā)出熒光信號，干擾檢測結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團(tuán)替代。目前淬滅基團(tuán)最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進(jìn)行多重qPCR檢測時(shí)，每個(gè)通道要選擇不同的熒光基團(tuán)，且避免各標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。

除此之外，Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)融合了高品質(zhì)Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)，可為您的科學(xué)研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結(jié)果。

?   數(shù)據(jù)可靠性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致，溫控jingzhun，性能穩(wěn)定可靠。

?  應(yīng)用靈活性

提供多種qPCR應(yīng)用分析，定制化報(bào)告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   交互靈活性

主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網(wǎng)絡(luò)交互。

同學(xué)們又是做qPCR實(shí)驗(yàn)的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點(diǎn)開“analysis”的呢？點(diǎn)開之后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還靠譜嗎？現(xiàn)在讓小編來告訴你，qPCR實(shí)驗(yàn)的成功與否，關(guān)鍵在于各組數(shù)據(jù)是否達(dá)到判定標(biāo)準(zhǔn)以及是否符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，小小的qPCR實(shí)驗(yàn)它可以變得很簡單，也可以變得很復(fù)雜，如何抓住qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵，是分析qPCR結(jié)果可信度的diyi步。

qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵

qPCR數(shù)據(jù)分析主要是利用Cq值進(jìn)行計(jì)算，所以我們需要了解qPCR反應(yīng)中幾個(gè)重要的參數(shù)，根據(jù)參數(shù)的表現(xiàn)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評估：

擴(kuò)增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數(shù)與qPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系。圖2反映的是隨著qPCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短。標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個(gè)增長階段（指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期）。

圖1：擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

圖2：擴(kuò)增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

基線：通常3-15個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴(kuò)增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。

閾值：是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動(dòng)設(shè)置是置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Cq值：qPCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時(shí)一般取Cq:15-35，太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

圖3：擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

評估qPCR反應(yīng)的效果

1、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

為了正確地評估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。擴(kuò)增效率E在90-110%之間時(shí)，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況。

R2值：評估PCR效率的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它是說明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預(yù)測X值。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值大于0.98時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

2、重復(fù)性

重復(fù)性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就小；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。例如，假設(shè)PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Cq間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250。總的來說，重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

圖5：8個(gè)重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

3、重現(xiàn)性

指不同批次之間或不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR結(jié)果的變化，通常表示為拷貝數(shù)或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺(tái)獨(dú)立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個(gè)樣本中可通過實(shí)驗(yàn)精確測量的最小拷貝數(shù)，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定ZD檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導(dǎo)致的。假設(shè)符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個(gè)拷貝。

圖7：5個(gè)數(shù)量級的動(dòng)態(tài)范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

5、準(zhǔn)確度

反映測量值和真實(shí)值的接近程度，以倍數(shù)變化或拷貝數(shù)進(jìn)行估算。

6、特異性

指qPCR實(shí)驗(yàn)中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會(huì)擴(kuò)增其他基因序列?？赏ㄟ^凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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Azure  Cielo?性能展示

?   高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復(fù)性

重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線高度重合

96孔重復(fù)結(jié)果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數(shù)（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準(zhǔn)確區(qū)分2倍濃度差異樣品

人內(nèi)參cDNA（GAPDH）進(jìn)行10個(gè)梯度，

2倍稀釋，3個(gè)重復(fù)，線性擬合度

R2=0.998，擴(kuò)增效率E=99.89%

你想從Western Blot小白進(jìn)階到實(shí)驗(yàn)高手嗎？想了解Z先進(jìn)的數(shù)字PCR定量技術(shù)嗎？想了解新冠病毒數(shù)字PCR檢測方案嗎？想知道不一樣的正倒置一體熒光顯微鏡嗎？想了解實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理與分析方法嗎？你想知道的問題都在深藍(lán)云直播課堂。

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對于做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的科研人員來說，引物探針是一個(gè)無比熟悉的詞語。不管是普通的PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準(zhǔn)度更高的數(shù)字PCR（dPCR），高質(zhì)量的引物和探針都是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也并非那么容易。好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果千篇一律，不好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產(chǎn)物或者擴(kuò)增不出產(chǎn)物等等。從實(shí)驗(yàn)小白到大神，不斷地學(xué)習(xí)和摸索是少不了的。針對不同的PCR在引物和探針設(shè)計(jì)上又有哪些不同呢？如何評估設(shè)計(jì)的引物和探針的質(zhì)量呢？為了讓您少走彎路，深藍(lán)云直播間與您在線交流如何獲得更優(yōu)的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實(shí)驗(yàn)助一份力！

目前，越來越多的領(lǐng)域都會(huì)用到數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，但關(guān)于實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果評估缺少一個(gè)共識。在很多發(fā)表的文章中都缺乏足夠的dPCR實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，這樣不利于評審文章，甚至難以根據(jù)文章重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

為了讓大家更好地遵循MIQE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家依托于法國Stilla Technologies的Naica數(shù)字PCR平臺(tái)發(fā)布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數(shù)字PCR技術(shù)檢測了乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并借此闡述了整個(gè)數(shù)字PCR操作流程以及如何運(yùn)用MIQE。

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PCR技術(shù)以特異性的寡核苷酸引物放大擴(kuò)增特定的DNA片段，一對引物在單次反應(yīng)擴(kuò)增單個(gè)基因。通常每個(gè)靶標(biāo)分別進(jìn)行檢測，即單重PCR反應(yīng)，但當(dāng)我們需要檢測多個(gè)靶標(biāo)基因時(shí)，單重PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力同時(shí)無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內(nèi)參基因的歸一化檢測，需要在同一反應(yīng)管中檢測內(nèi)參基因和目標(biāo)基因，多重PCR實(shí)驗(yàn)無疑是最簡單直接的解決方案。

多重PCR也稱復(fù)合PCR,是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種PCR擴(kuò)增技術(shù),即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（digital PCR）技術(shù)中，多重PCR設(shè)計(jì)配合多熒光通道可以進(jìn)行更多靶標(biāo)的相對于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測和直接的JD定量檢測，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時(shí)又比單重PCR更加GX、快捷和經(jīng)濟(jì)。

多重PCR實(shí)驗(yàn)具體如何進(jìn)行？又有哪些注意事項(xiàng)？實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR如何和多重PCR結(jié)合？北京深藍(lán)云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

想要了解更多關(guān)于單重PCR和多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相關(guān)信息，快來參加5月13號的直播課堂吧！

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　本生課堂：實(shí)驗(yàn)室微量移液器小知識

　　微量移液器是一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，用于精確地量取和轉(zhuǎn)移少量液體。市場上有幾種類型的微量移液器，可根據(jù)以下類型進(jìn)行分類：

　　體積：固定或可變體積的微量移液器

　　操作原理：空氣置換或容積式微量移液器。

　　操作機(jī)構(gòu)：機(jī)械或電子微量移液器

　　通道數(shù)：單通道或多通道微量移液器。

　　學(xué)會(huì)正確使用微量移液器被認(rèn)為是一項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)室技能，它是微生物實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、大學(xué)和研究實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的工具。

　　微量移液器部件：

　　盡管微量移液器不盡相同，但所有微量移液器的基本部件都是相同的:

　　柱塞是微量移液器的最頂端部分，用于調(diào)節(jié)體積以及將所需量的液體吸入和分配到微量移液器的。柱塞中有兩個(gè)擋塊，用于在正向和反向移液中吸取液體。

　　彈出按鈕：只需按下吸頭彈出按鈕，即可輕松從微量移液器中取出吸頭，而無需接觸它們。

　　容量窗口：調(diào)整后的容量顯示在容量窗口中(要吸入/分配的容量)。

　　微量移液器軸：是充滿空氣的管子。推動(dòng)活塞排出桿中包含的一定體積的空氣，釋放活塞允許這些空氣返回桿。

　　微量移液器吸頭：是附在微量移液器上的吸頭，用于收集液體，然后將其從一個(gè)地方轉(zhuǎn)移到另一個(gè)地方。不同尺寸的吸頭用于收集不同體積的液體。

　　微量移液器的類型：

　　根據(jù)體積的微量移液器類型

　　固定體積微量移液器：固定體積微量移液器的體積不能改變，每次分配時(shí)分配相同數(shù)量的液體。

　　可變體積微量移液器：可以根據(jù)微量移液器的容量(特定的最小和體積范圍)調(diào)整要吸取或分配的液體體積。

　　根據(jù)操作機(jī)制的微量移液器類型：

　　機(jī)械移液器中的柱塞壓力和真空被電動(dòng)移液器中的按鈕所取代，并且可以對電動(dòng)移液器進(jìn)行編程以遵循您的工作協(xié)議。

　　排氣式微量移液器：當(dāng)柱塞被壓下時(shí)，它會(huì)下降到儀器內(nèi)部以排出空氣。排出的空氣量等于吸入/分配的液體量。

　　容積式微量移液器：柱塞與樣品直接接觸，在這些微量移液器中，包含筒和柱塞(如注射器)。

　　微量移液器如何工作?

　　當(dāng)柱塞被按下時(shí)，由于微量移液器吸頭中的液體也被推出的力，微量移液器套管內(nèi)的空氣被排出。

　　當(dāng)活塞向上運(yùn)動(dòng)時(shí)，在活塞騰出的空間內(nèi)產(chǎn)生真空。這導(dǎo)致吸嘴中的空氣上升以填充空置空間，然后吸嘴中的空氣被吸入吸嘴的液體代替。

　　【本文標(biāo)簽】 移液器 吸頭 移液器吸頭 微量移液器

　　本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結(jié)束，你需要驗(yàn)證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍(lán)云直播課堂吧！

四線測試法被認(rèn)為是目前為止zui好的消除引線電阻引入誤差（或?qū)⑵鋵⒅磷钚〉模┑臏y試方案，作為初學(xué)者來說，除了了解測試方法，了解它的原理及優(yōu)勢也是非常有必要的，今天安泰測試就給大家介紹一下四線法測量的原理及特點(diǎn)：

（一）、四線法原理介紹

四線法，我們也可以稱為四端點(diǎn)測量技術(shù)、開爾文測量法，是一種電子線路中的阻抗測量法，主要用于電阻阻值的精確測量。

（二）、二線法測量的局限

當(dāng)我們在使用二線法測量電阻時(shí)，根據(jù)歐姆定律R=U/I，不論是近距離還是遠(yuǎn)距離測量阻值，測量結(jié)果都會(huì)受到導(dǎo)線電阻的影響，導(dǎo)致電壓下降，遠(yuǎn)距離測量時(shí)由于導(dǎo)線更長造成的壓降(電壓下降)更大而造成不可忽略的影響。在實(shí)際測量中受限于某些條件而只能遠(yuǎn)距離測量電壓，此時(shí)由于遠(yuǎn)距離測量中大電流流經(jīng)長導(dǎo)線造成了不可忽視的壓降，而對測量電阻阻值造成影響。

（三）、四線法如何精準(zhǔn)測量

四線式測量方法示意圖

四線法測量由額外導(dǎo)線引至伏特計(jì)，則可避免測量電阻時(shí)受到導(dǎo)線電阻造成的壓降影響。由于伏特計(jì)內(nèi)電阻極大，流經(jīng)伏特計(jì)的電流值相比于流經(jīng)待測電阻電流值小到可忽略，所以額外導(dǎo)線產(chǎn)生的壓降不會(huì)對測量結(jié)果造成影響。此時(shí)所測電壓與安培計(jì)所測電流之比即可近似為被測電阻阻值。

（四）、四線法測量的優(yōu)點(diǎn)

1、導(dǎo)線電阻產(chǎn)生的電壓差幾乎為零，不影響電壓測量結(jié)果。

2、由于僅有極小部分的電流(小到可忽略)流經(jīng)伏特計(jì)，故也不影響電流測量結(jié)果。

3、待測電阻為低電阻，同樣可精準(zhǔn)測量。

你對四線制測量方法了解多少呢？你會(huì)使用四線制測量嗎？如果您在用四線制測量過程中有什么問題，歡迎訪問安泰測試網(wǎng)。

顯微鏡是由一個(gè)透鏡或幾個(gè)透鏡的組合構(gòu)成的一種光學(xué)儀器，是人類進(jìn)入原子時(shí)代的標(biāo)志。顯微鏡是人類最偉大的發(fā)明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長期使用顯微鏡的小伙伴們，長期觀察目鏡筒是否會(huì)感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發(fā)現(xiàn)時(shí)是否會(huì)困擾如何去跟別人描述新發(fā)現(xiàn)的位置？想要記錄視野圖像時(shí)是否需要反復(fù)的找合適角度拍照？

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直播課

整個(gè)小鼠胚胎的圖像：（左）原始寬場成像結(jié)果和（右）應(yīng)用Large Volume Computational Clearing（LVCC）后的成像結(jié)果。圖片來源：A. Popratiloff和Z. Motahari，美國喬治·華盛頓大學(xué)。

本文介紹了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）對小鼠胚胎快速、高對比度成像，實(shí)現(xiàn)了對軸突生長和腦神經(jīng)發(fā)育的研究。許多在發(fā)育早期階段損害神經(jīng)回路發(fā)育的遺傳性疾病被認(rèn)為會(huì)對行為造成干擾。用小鼠模型研究早期神經(jīng)發(fā)育的細(xì)胞變化、定義與人類疾病相似的行為及潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的。而鑒別發(fā)育的神經(jīng)元回路中三叉神經(jīng)（其參與面部感覺和運(yùn)動(dòng)機(jī)能）軸突生長的早期分化，使得這些困難迎刃而解。

簡介

人們普遍認(rèn)為，很多遺傳性疾病都通過損害神經(jīng)回路發(fā)育的早期階段來對行為產(chǎn)生干擾[1]。事實(shí)證明，在模型動(dòng)物中分辨早期神經(jīng)發(fā)育中細(xì)胞的此類變化具有一定的難度。用與人類遺傳性疾病中臨床顯著缺陷相似的基因突變小鼠模型來定義行為、神經(jīng)回路和潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的[1]。檢測單個(gè)神經(jīng)元初始分化中的變化難以實(shí)現(xiàn)。這些挑戰(zhàn)可通過確定發(fā)育的神經(jīng)回路中三叉神經(jīng)這一關(guān)鍵組分的軸突生長的早期分化來解決[1]。通過著眼于參與面部感覺及運(yùn)動(dòng)機(jī)能如哺乳、進(jìn)食、咬、咀嚼和吞咽等的三叉神經(jīng)（腦神經(jīng)V），以及軸突生長和原生傳導(dǎo)通路，可以對使用組織學(xué)處理可能會(huì)缺失的三維環(huán)境進(jìn)行研究[1]。本文介紹如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]對小鼠胚胎快速、高對比度成像，以幫助進(jìn)行腦神經(jīng)發(fā)育研究。

挑戰(zhàn)

如要以實(shí)用高效的方式對整個(gè)小鼠胚胎成像，快速、清晰的高對比度3D成像解決方案，對于重要細(xì)節(jié)展示和解析大有益處。相較于激光共聚焦成像，可在很短的時(shí)間內(nèi)一次性采集到完整胚胎的成像結(jié)果。傳統(tǒng)寬場顯微成像速度快，檢測靈敏度高，但是對厚標(biāo)本的成像，如小鼠胚胎，通常會(huì)由于非焦平面信號的影響，呈現(xiàn)模糊的成像結(jié)果，降低圖像對比度[2,3]。

方法

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture對小鼠胚胎成像。使用抗βIII微管蛋白（Tuj1）抗體對胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)和腦神經(jīng)進(jìn)行染色。結(jié)合BABB透明化處理，即可對整個(gè)胚胎中的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)成像。圖1中的圖像使用數(shù)值孔徑（NA）0.75、工作距離700μm的20x多浸液物鏡采集。該圖像由32個(gè)視野拼接組成，成像深度為672 μm（337層切），采集了完整的胚胎結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)采集總時(shí)長為18分鐘。

結(jié)果

通過LVCC和Instant Computational Clearing（ICC）將寬場成像固有的非焦面模糊信號清除[2,3]。之后，再使用徠卡自適應(yīng)式反卷積技術(shù)來增強(qiáng)三維特征結(jié)構(gòu)的分辨率[4]。這種成像模式便于觀察胚胎的神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及胚胎的整體布局中更有價(jià)值的神經(jīng)元定位。

圖1：展示整個(gè)小鼠胚胎的俯視圖，顯示原始數(shù)據(jù)（A）與應(yīng)用LVCC后（B）的差異。根據(jù)相對物鏡深度進(jìn)行顏色標(biāo)識的胚胎的角度視圖，其中zui大深度為672 μm。C）應(yīng)用LVCC后的腦部側(cè)視圖，顯示了沿Z軸方向的精密細(xì)節(jié)。圖片來源：Anastas Popratiloff博士和Zahra Motahari博士，喬治·華盛頓大學(xué)納米制造與成像中心（GWNIC），美國華盛頓特區(qū)。

結(jié)論

與傳統(tǒng)的寬場成像不同，THUNDER技術(shù)Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]在對小鼠胚胎中的腦神經(jīng)發(fā)育成像時(shí)，顯著增強(qiáng)了圖像對比度，對精密細(xì)節(jié)有更好的解析。

References：

1.Z. Motahari, T.M. Maynard, A. Popratiloff, S.A. Moody, A.-S. LaMantia, Aberrant early growth of individual trigeminal sensory and motor axons in a series of mouse genetic models of 22q11.2 deletion syndrome, Human Molecular Genetics (2020) vol. 29, iss. 18, pp. 3081-3093, DOI: 10.1093/hmg/ddaa199.

2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

4.V. Kohli, J.M. Marr, O. Schlicker, L. Felts, The Power of Pairing Adaptive Deconvolution with Computational Clearing: Technical Brief, Science Lab (2021) Leica Microsystems. 

相關(guān)產(chǎn)品

THUNDER Imager 3D Live Cell 和 3D Cell Culture