《背景介紹》

  構(gòu)建熒光猝滅免疫層析試紙條（FQ-ICTS）有利于實現(xiàn)靶標的靈敏檢測，但較低的猝滅效率限制了FQ-ICTS的進一步發(fā)展。FQ-ICTS的性能依賴于受體對供體的高效猝滅，以實現(xiàn)超低熒光背景信號。因此，必須最大限度地提高受體的猝滅能力，以進一步提高FQ-ICTS的分析靈敏度。闡明FQ-ICTS的猝滅機理，探索影響猝滅效率的主要因素，有利于制備優(yōu)良的受體猝滅劑。通常，FQ-ICTS的機理為內(nèi)濾效應(yīng)（IFE）或熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。IFE依賴于供體-受體光譜重疊，具有不受供體-受體距離限制的特點，但其信號輸出可能受到非特異性干擾的缺點（如來自實際樣品中非目標的散射光與供體的吸收/發(fā)射光譜重疊）。與IFE相比，FRET雖然可以通過抗原-抗體特異性結(jié)合避免其他物質(zhì)的干擾，但其在距離限制<10nm。納米金屬表面共振能量轉(zhuǎn)移（NSET）能夠克服10nm的限制，并且在更長的距離（1至40nm）仍具有出色的猝滅效率。然而，基于獨特NSET機制的FQ-ICTS的探索仍處于早期階段。因此，構(gòu)建一種新型的NSET-ICTS并探索影響其性能的關(guān)鍵因素對于實現(xiàn)靶標的高靈敏度檢測具有重要意義。

  近期，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與營養(yǎng)創(chuàng)新團隊黃現(xiàn)青/宋蓮軍/張西亞教授報道了一種創(chuàng)新的NSET-ICTS，利用時間分辨熒光微球（TRFM）結(jié)合T2-BSA作為供體，以五種球形和花形金粒子（AuNPs-520，AuNPs-542，AuNPs-558，AuNPs-588，，AuNPs-605）標記的單克隆抗體（mAb）作為受體，通過調(diào)節(jié)AuNPs-mAb不同的吸收波長，探索供體-受體重疊面積對猝滅效率的影響規(guī)律，篩選出具有最高猝滅效率的NEST對，實現(xiàn)對T2毒素的高靈敏檢測。相關(guān)成果以“Fortified Donor?Acceptor Spectral Overlap Facilitated Fluorescence Quenching Efficiency for Developing Sensitive Nanometal Surface Energy Transfer-Based Immunochromatographic Test Strips”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c06702）。

研究的主要內(nèi)容

  該研究首先根據(jù)Stern?Volmer方程計算猝滅常數(shù)K_sv(λ)，供體熒光壽命變化及供體-受體之間的?？怂咕嚯x，驗證了TRFMs-T-2-BSA與AuNPs-mAb之間的猝滅機制為NSET。隨后研究了供體-受體重疊積分面積和猝滅效率以及NSET-ICTS的靈敏度之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著供體-受體的重疊積分面積的擴大，猝滅效率增加。隨著AuNPs吸收波長的紅移，供體與受體的重疊積分面積由7.75×10¹⁹增加到4.68×10²³ M^-1 cm^-1nm⁴，熒光猝滅效率由18.6%增加到92.7%。同時，相應(yīng)的NSET-ICTS的IC₅₀值（0.62、0.42、0.22ng/mL）和qLOD（0.078、0.048、0.034ng/mL）均逐漸降低。在以TRFMs-610-T2-BSA為供體、以AuNPs-605-mAb為受體的配對中獲得了最大的熒光猝滅效率92.7%，NSET-ICTS的檢測限低至0.034 ng/mL，比傳統(tǒng)的AuNPs-ICTS提高了13.2倍，具有良好的特異性和重復(fù)性。該傳感器可以很好地應(yīng)用于實際玉米樣品的T2監(jiān)測，回收率滿足要求（95.5%至108.7%），與HPLC-MS/MS的結(jié)果有很好的相關(guān)性。

圖一：

圖1（A）供體和受體的制備，（B）供體-受體光譜重疊面積對猝滅效率影響示意圖，（C）基于NSET-ICTS用于檢測T2毒素的示意圖（來源：Analytical Chemistry）

圖二：

圖2 （A）AuNPs-520、（B）AuNPs-542、（C）AuNPs-558、（D）AuNPs-588 和（E）AuNPs-605的TEM和粒徑圖。（F）最大吸收波長為520、542、558、588和605 nm的AuNPs的紫外可見光譜。（G）AuNPs和AuNPs-mAb的Zeta電位。（H）TRFMs的TEM圖。（I）TRFMs與EDC/NHS的活化摩爾比。（J）TRFMs標記T2-BSA的優(yōu)化。（K）TRFMs和TRFMs-T2-BSA的Zeta電位、（L）流體動力學(xué)尺寸和（M）熒光發(fā)射光譜。（來源：Analytical Chemistry）

圖三：

圖3 不同濃度的（A）AuNPs-605-BSA和（B）T2（0.03 nmol/LAuNPs-605-BSA）存在下TRFMs-T2-BSA的熒光光譜。不同濃度的（C）AuNPs-605-mAb和（D）T2（0.03 nmol/LAuNPs-605-mAb）存在下TRFMs-T2-BSA的熒光光譜。（E）TRFMs-T2-BSA-AuNPs-605-mAb和TRFMs-T2-BSA-AuNPs-605-BSA的Stern-Volmer圖。（F）供體、供體分別與AuNPs-605-BSA和AuNPs-605-mAb反應(yīng)時的熒光壽命。（來源：Analytical Chemistry）

圖4 （A-E）受體的吸收光譜和供體的發(fā)射光譜?；冢?/span>F）AuNPs-520-mAb、（G）AuNPs-542-mAb、（H）AuNPs-558-mAb、（I）AuNPs-588-mAb和（J）AuNPs-605-mAb的ICTS在日光和紫外線下檢測不同濃度T2的照片。編號1-7分別代表0、0.125、0.25、0.5、1、2和4 ng/mL的T2。（K）用于T2檢測的NSET-ICTS示意圖。（L）AuNPs-558-mAb、（M）AuNPs-588-mAb和（N）AuNPs-605-mAb的ICTS檢測T2的標準曲線。（O）其它分析技術(shù)檢測T2的靈敏度比較。（P）不同受體與TRFMs-T2-BSA結(jié)合的重疊積分面積與構(gòu)建的NSET-ICTS的猝滅效率、qLOD的關(guān)系。（來源：Analytical Chemistry）

表1 AuNPs-mAb的ε₆₁₀、重疊面積、猝滅效率和NSET-ICTS的性能總結(jié)

圖5 NSET-ICTS在可見光（A、C）和紫外線（B、D）下檢測不同干擾毒素的特異性結(jié)果。編號1-9代表對照、DON、ZEN、FB1、OTA、NIV、T-2 四醇、HT-2 和T2。（來源：Analytical Chemistry）

圖6 （A）NSET-ICTS檢測不同稀釋度基質(zhì)中T2的標準曲線比較。（B）NSET-ICTS檢測玉米中T2的回收率。（C）NSET-ICTS與HPLC-MS/MS 之間的T2相關(guān)性分析。（來源：Analytical Chemistry）

  綜上所述，成功開發(fā)了一種基于TRFMs-T2-BSA-AuNPs-mAb的新型NSET-ICTS，用于玉米樣品中T2的靈敏檢測。系統(tǒng)地探索了NSET-ICTS的猝滅機理，并證明為NSET。通過調(diào)節(jié)受體的紫外吸收波長，研究了供體-受體重疊積分面積對猝滅效率的影響，表明增加重疊面積可實現(xiàn)高效猝滅效率，從而提高NSET-ICTS的靈敏度。得益于AuNPs-605和TRFMs的高猝滅效率(92.7%)，TANT-ICTS實現(xiàn)了檢測T2的qLOD為0.034 ng/mL，比傳統(tǒng)AuNPs-ICTS的檢測限顯著降低。此外，該方法還用于實際玉米樣品種T2的檢測，并與HPLC-MS/MS的結(jié)果良好相關(guān)，顯示出較好的準確性。這項工作表明NEST機制在提高ICTS性能方面具有廣闊的前景，并為實現(xiàn)猝滅型免疫層析的高效猝滅提供了一種創(chuàng)新思路。