細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)艱難的工作。因?yàn)檫@是一個(gè)高度技術(shù)性的過程，當(dāng)你從一個(gè)來源提取細(xì)胞并在另一個(gè)條件下去對(duì)他們進(jìn)行操作時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)很多問題，比如受到外界的污染，或者生長(zhǎng)速度非常緩慢。

但其中也有許多是我們可以去控制的。在過去的100多年里，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一些Z 具革命性的進(jìn)步做出了貢獻(xiàn)，促進(jìn)了我們對(duì)癌癥等疾病的理解，并支撐了安全有效的治 療方法的發(fā)展。

幸運(yùn)的是，現(xiàn)在人們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的了解比20世紀(jì)初體外培養(yǎng)先驅(qū)羅斯·哈里森（Ross Harrison）在玻片上分析青蛙組織時(shí)多得多。在本指南中，我們分享了一個(gè)多世紀(jì)來培育活細(xì)胞的基本知識(shí)，包括如何接種、增殖和收獲。

低溫狀態(tài)下的細(xì)胞接種

在購(gòu)買細(xì)胞培養(yǎng)品系時(shí)，產(chǎn)品是冷凍保存的，這對(duì)長(zhǎng)期保持細(xì)胞活力是必要的。在這種狀態(tài)下，你需要解凍并進(jìn)行細(xì)胞接種，這個(gè)過程應(yīng)當(dāng)是非常謹(jǐn)慎小心的，即便它發(fā)生得很快。然而，這一重要的步驟的經(jīng)常匆忙進(jìn)行，有時(shí)很多細(xì)節(jié)甚至被忽視，這就存在了細(xì)胞被污染的風(fēng)險(xiǎn)，也沒有給細(xì)胞提供它們所需要的良好的、無(wú)菌的開始。

以下是進(jìn)行細(xì)胞接種的正確方法：

? 準(zhǔn)備好所需的所有的器具。你需要一個(gè)冷凍的小瓶子、一個(gè)燒杯或水浴槽，裝滿預(yù)熱的水，和一個(gè)裝有預(yù)平衡介質(zhì)的燒瓶。如果你打算降低細(xì)胞的活躍度并去除DMSO或其他低溫保護(hù)劑，你還需要一個(gè)錐形瓶用于盛裝這些介質(zhì)。

? 加熱小瓶子。在裝有預(yù)熱過的水的燒杯中輕輕攪動(dòng)冷凍的小瓶子，直到里面的組分幾乎完全融化。然后，用酒精濕巾清潔小瓶，以減少被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

? 接種細(xì)胞。使用移液管，從冷凍液中取出細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到燒瓶中。然后用移液器反復(fù)吸取混勻溶液，以便接種。這樣，你的細(xì)胞就會(huì)被解凍、轉(zhuǎn)移、并準(zhǔn)備好進(jìn)入培養(yǎng)箱（或用于去除DMSO的離心機(jī)）。

細(xì)胞數(shù)量隨著細(xì)胞增殖而擴(kuò)大

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度后，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離傳代。你需要掌握正確的細(xì)胞分離方法。細(xì)胞增殖是細(xì)胞培養(yǎng)的必要部分，依賴于效率和一致性。如果使用的工作流程效率低下，可能會(huì)提高供應(yīng)和人工成本；如果遵循了前后不一致的工作流程，則可能會(huì)給您的細(xì)胞帶來過度壓力，并殺死它們。

達(dá)到目的的方式取決于你的對(duì)于實(shí)驗(yàn)容器的選擇。市面上有非常多的選擇，比如使用i-Quip?容器，可以幫助生命科學(xué)家在更小的空間中建立友好的環(huán)境，以實(shí)現(xiàn)更快的生長(zhǎng)，也更多的減少勞動(dòng)力和污染風(fēng)險(xiǎn)。

因?yàn)椴皇撬械娜萜鞫季哂邢嗤纳L(zhǎng)面積，研究人員通常會(huì)考慮細(xì)胞/cm2的產(chǎn)量來決定他們的容器選擇和相關(guān)試劑的用量。然后，他們將利用這一技術(shù)持續(xù)地進(jìn)行細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)，使其達(dá)到研究人員所需的細(xì)胞數(shù)量。為了獲得Z 佳生長(zhǎng)效果，通過以下操作保持細(xì)胞/cm2和mL/cm2的比例穩(wěn)定來選擇容器和試劑：

? 使用這個(gè)公式來計(jì)算您的細(xì)胞數(shù)量，以容器為單位：[(所需細(xì)胞/cm2)×(容器的面積cm2)]；

? 應(yīng)用這個(gè)公式來計(jì)算每個(gè)容器所需的試劑量：[(期望mL數(shù)/ cm2)×(容器的面積cm2)]。為了達(dá)到Z 佳的細(xì)胞生長(zhǎng)和氣體擴(kuò)散，大多數(shù)情況下每cm2的細(xì)胞生長(zhǎng)面積將需要0.2 mL到0.5 mL的培養(yǎng)基。

收獲你的貼壁細(xì)胞

當(dāng)細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為單層時(shí)，你就知道它們已經(jīng)準(zhǔn)備好被收獲了。實(shí)驗(yàn)員們一般會(huì)通過化學(xué)或物理手段分離細(xì)胞。

一種方法是通過解離試劑進(jìn)行化學(xué)分離，需要針對(duì)細(xì)胞類型和應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，以確保細(xì)胞不受試劑的負(fù)面影響。相比之下，對(duì)于可能不耐受解離試劑的強(qiáng)黏附、敏感細(xì)胞，通過細(xì)胞刮除器進(jìn)行物理清除可能是更好的方法。同時(shí)還需要考慮下游應(yīng)用場(chǎng)景，以及如何或是否解離試劑可能影響您的研究。

如果您選擇使用解離試劑，請(qǐng)使用移液管無(wú)菌地遵循以下操作步驟：

? 從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)基；

? 向培養(yǎng)瓶中加入PBS等緩沖溶液，以去除可能干擾解離劑的任何微量血清。輕輕搖動(dòng)容器，使里面的溶液均勻。浸泡10到15分鐘以分離哪些難以分離的細(xì)胞系。移去緩沖液；

? 以0.02到0.03 mL/cm2的比例添加解離試劑。根據(jù)細(xì)胞系或解離試劑的特性，在37℃孵育可以促進(jìn)解離；

? 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)呈現(xiàn)圓形，但還沒有開始聚集時(shí)，它們就已經(jīng)準(zhǔn)備好了——就好像你在看一個(gè)充滿了成千上萬(wàn)顆星星的夜空。溶液開始變得渾濁是一個(gè)好跡象，表明它們已經(jīng)準(zhǔn)備好被分離了；

? 用緩沖液或含血清的培養(yǎng)基稀釋解離試劑，通常以1:1的比例稀釋。在去除整個(gè)溶液并將其轉(zhuǎn)移到試管內(nèi)之前，上下吸取幾次以混勻；

? 如果細(xì)胞對(duì)試劑特別敏感，則建議通過離心法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。

現(xiàn)在你的細(xì)胞可以計(jì)數(shù)了，同時(shí)也可以對(duì)其細(xì)胞密度和活力進(jìn)行測(cè)量了。

通過細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)成你的研究

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)可以為你的實(shí)驗(yàn)室打開一個(gè)實(shí)驗(yàn)和下游應(yīng)用的全新世界——它同樣也可以很有趣。但當(dāng)你操縱活體細(xì)胞時(shí)，可能會(huì)有很多風(fēng)險(xiǎn)，所以正確的操作非常重要。通過遵循這些基本的指示，并努力達(dá)成更完善的操作流程，你可以逐步成長(zhǎng)為一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)專家。