免疫印跡法就是將蛋白質(zhì)往膜上轉(zhuǎn)移，之后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。能夠使用相應(yīng)抗體作為一抗對(duì)已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，能夠通過(guò)融合部分的抗體對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

原理

Western Blot類(lèi)似于Southern或Northern雜交方法，然而其采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，用標(biāo)記的二抗來(lái)“顯色”，抗體為“探針”，蛋白質(zhì)為被檢測(cè)物。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品往固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上轉(zhuǎn)移，固相載體以非共價(jià)鍵形式來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸附，并且可以使其生物學(xué)活性和電泳分離的多肽類(lèi)型保持不變。抗原使用固相載體上的蛋白質(zhì)或多，和對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)放射自顯影或者底物顯色來(lái)對(duì)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)也在蛋白水平的表達(dá)的檢測(cè)方面得到廣泛地應(yīng)用。

試劑準(zhǔn)備

1、0.01M PBS(pH7.4）：

Na2HPO4 1.44g；

KH2PO4 0.24g；

NaCl 8.0g；

KCl 0.2g；

加ddH2O至1000ml。

2、膜染色液：

乙酸2ml；

ddH2O118 ml；

包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

考馬斯亮蘭 0.2g；

甲醇80ml。

3、顯色液：

硫酸鎳胺 0.1ml；

H202 1.0μl；

DAB 6.0mg；

0.01M PBS 10.0ml。

4、SDS-PAGE試劑：見(jiàn)電泳實(shí)驗(yàn)。

5、勻漿緩沖液：

10%SDS 6.0ml；

1.0M Tris-HCl(pH 6.8)；

1.OmlddH2O 2.8ml；

β-巰基乙醇 0.2ml。

6、轉(zhuǎn)膜緩沖液：

SDS 0.37g；

甲醇200ml；

甘氨酸 2.9g；

Tris 5.8g；

加ddH2O定容至1000ml。

注意事項(xiàng)

1、DAB有潛在可能致癌，要小心仔細(xì)地操作。

2、使用時(shí)必須新鮮配置顯色液，Z后將H2O2加入。

3、不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度的Z佳條件。