免疫沉淀簡(jiǎn)介

免疫沉淀（IP）是應(yīng)用Z廣泛的免疫化學(xué)技術(shù)之一。免疫沉淀，然后是SDS-PAGE和免疫印跡，通常用于各種應(yīng)用，例如：確定蛋白質(zhì)抗原的分子量，研究蛋白質(zhì)間相互作用，確定特異性酶活性，監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾，并確定蛋白質(zhì)的存在和數(shù)量。IP技術(shù)還能夠檢測(cè)稀有蛋白質(zhì)，否則很難檢測(cè)，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^免疫沉淀濃縮到1×104倍。

在IP方法中，來自細(xì)胞或組織勻漿的蛋白質(zhì)通過免疫復(fù)合物在適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液中沉淀，所述免疫復(fù)合物包括抗原（蛋白質(zhì)）、第 一抗體和蛋白質(zhì)A-、G-或L-蔗糖綴合物或第二抗體瓊脂糖綴合物。瓊脂糖綴合物的選擇取決于初級(jí)抗體的物種來源和同種型。所描述的方法是可比較的，并且方法的選擇取決于特異性抗原抗體系統(tǒng)。

試劑和設(shè)備

1.瓊脂糖綴合物：固定在Sepharose?CL-4B（產(chǎn)品編號(hào)P405880）或G蛋白瓊脂糖4B（產(chǎn)品編號(hào)R394624）或L蛋白瓊脂糖（產(chǎn)品編號(hào)P394623）上的A蛋白，或抗體-瓊脂糖綴合體（根據(jù)第一抗體的物種來源和同種型的第二抗體綴合物）

2.細(xì)胞或組織裂解物制備

3.免疫沉淀一級(jí)抗體和非相關(guān)抗體（陰性對(duì)照）

4.SDS-PAGE和免疫印跡試劑及設(shè)備

5.HNTG緩沖液：20mM HEPES緩沖液，pH 7.5（產(chǎn)品編號(hào)H109406），含有150mM NaCl（產(chǎn)品編號(hào)S301560）、0.1%（w/v）Triton X-100（產(chǎn)品編號(hào)T434565）和10%（w/v）甘油（產(chǎn)品編號(hào)G424796）

6.洗滌緩沖液（冰冷）：HNTG緩沖液，或PBS pH 7.4（產(chǎn)品編號(hào)R355028），或根據(jù)所需洗滌嚴(yán)格程度的其他緩沖液（RIPA緩沖液 產(chǎn)品編號(hào) R488105）

7.具有或不具有2-巰基乙醇（2-ME（產(chǎn)品編號(hào)M301574））的萊姆利樣品緩沖液（例如1x、2x或3x）

8.微型離心管

9.微型離心機(jī)和振動(dòng)篩

免疫步驟

特異性抗原的免疫沉淀

注意：除非另有說明，否則在冰上使用微型離心管執(zhí)行所有IP步驟。

用洗滌緩沖液洗滌瓊脂糖綴合物兩次，在室溫下以12000xg離心10秒，丟棄上清液。

注意：如果瓊脂糖綴合物是粉末，則用去離子H2O將其重建，并使其膨脹5分鐘。

在洗滌緩沖液（50%懸浮液）中重新懸浮瓊脂糖綴合物。

根據(jù)需要，繼續(xù)使用方法A或方法B。

方法A

1.在微量離心管中將瓊脂糖綴合物分成50-100μL（約25-50μL瓊脂糖/床體積）的等分試樣。

2.在每根試管中加入10μL適當(dāng)稀釋的初級(jí)抗體。

3.在室溫下培養(yǎng)15-60分鐘，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

4.在4°C下以3000xg離心2分鐘，丟棄上清液。

5.用1mL洗滌緩沖液洗滌每個(gè)樣品，在4°C下以3000xg離心2分鐘，重復(fù)此步驟至少兩次。

6.向每根試管中加入0.1-1.0 mL的細(xì)胞裂解物。

7.在4°C下培養(yǎng)90分鐘至過夜，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

8.通過在4°C下以3000xg離心2分鐘來收集免疫沉淀的復(fù)合物，丟棄上清液。

9.用1 mL洗滌緩沖液洗滌顆粒，在4°C下以3000xg離心2分鐘。重復(fù)此步驟至少3次。

方法B

1.向細(xì)胞裂解物樣品（0.1-1.0 mL）中加入10μL適當(dāng)稀釋的抗體（參考產(chǎn)品規(guī)范）。

2.在4°C下培養(yǎng)90分鐘至過夜，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

3.加入50-100μL瓊脂糖綴合物懸浮液（約25-50μL瓊脂糖/床體積）。

4.在4°C下培養(yǎng)15-60分鐘，用搖壺輕輕混合樣品。

5.通過在4°C下以3000xg離心2分鐘來收集免疫沉淀的復(fù)合物，丟棄上清液。

6.通過重懸浮和在4°C下以3000xg離心2分鐘，用1ml洗滌緩沖液洗滌顆粒。重復(fù)此步驟至少3次。

SDS-PAGE的制備

1.將每個(gè)顆粒重新懸浮在25-100μL萊姆利樣品緩沖液中，Z 終濃度為1x樣品緩沖液，將樣品在95°C下加熱5分鐘。

2.在室溫下以12000xg離心30秒。收集上清液（IP樣品）。如果需要，（在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性允許的情況下）IP樣品可以儲(chǔ)存在-70°C的樣品緩沖液中。

3.在SDS-PAGE上運(yùn)行已知濃度的樣品和MW標(biāo)準(zhǔn)品（聚丙烯酰胺凝膠的適當(dāng)百分比取決于蛋白質(zhì)的分子大小）。

4.轉(zhuǎn)移到硝化纖維上，進(jìn)行免疫印跡。

免疫沉淀（IP）的常見問題及解答

1. 用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗(yàn)？ 

答：抗體的性質(zhì)對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)影響很大。抗體不同，和抗原以及Protein G或Protein A的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。一般來說，多抗是沉淀反應(yīng)Z 佳的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑 制劑？ 

答：從活性細(xì)胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測(cè)蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3. 溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？ 

答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。

4. 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？ 

答：每次沉淀實(shí)驗(yàn)之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5. 免疫沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？ 

答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和；DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。

參考文獻(xiàn)

[1] Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.

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