流式細胞表面染色主要針對活細胞進行染色，不需要對細胞固定和破膜。
染色流程主要包含以下四步
第一步 樣品制備
在往期Dr.賽流式小課堂中，我們給大家介紹了幾種流式樣本制備的方法?？牲c擊下方鏈接回顧相關(guān)內(nèi)容：
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了解不同來源單細胞懸液的具體制備方法
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問
我需要準備多少細胞來做流式細胞表面染色呢？
答
在單次流式染色體系中，細胞懸液體積通常為100 μL，建議細胞數(shù)量為106個。可以根據(jù)設(shè)置的對照組和實驗組數(shù)目來確定染色所需的細胞懸液體積和細胞量。
第二步 Fc受體封閉（可選）
Fc受體封閉可減少抗體的非特異性結(jié)合，降低實驗中高背景及假陽性等問題。但并不是所有的表面染色都要做Fc受體封閉，我們可以依據(jù)具體樣本類型來判斷其必要性。關(guān)于更多Fc受體相關(guān)問題，請點擊下方圖片查看往期干貨知識。
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這里帶大家回顧一下Fc受體封閉的具體操作流程：
對于含有 106個細胞的100 μL細胞懸液，加入Fc受體封閉試劑，置于冰上或室溫預孵育10-20分鐘。封閉之后一般無需清洗即可進行流式抗體染色。
注：小鼠樣本用0.5-1 μL抗小鼠CD16/32抗體；人源樣本用20 μL人Fc受體抑制劑。
第三步 抗體染色
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染色體系
如第一步“樣品制備”所述，一個流式染色體系通常為100 μL細胞懸液，包含1X106個細胞?？贵w染色buffer通常推薦使用商業(yè)化的流式染色緩沖液（eBioscience? 流式染色緩沖液，貨號00-4222-57）或者是含有一定濃度牛血清白蛋白或胎牛血清的PBS。
我應如何確定抗體用量呢？
通常來說商品化的流式抗體提供建議用量，可先根據(jù)建議用量進行嘗試。以賽默飛的CD86抗體（貨號：12-0862-82）為例（如下圖所示），該抗體建議用量為0.125 μg/test。該抗體的濃度為0.2 mg/mL，因此在100 μL細胞懸液中加入抗體的體積為0.625 μL?；蛘咭酝扑]的抗體用量為基礎(chǔ)，使用自己的樣本進行抗體滴定，來找到一個更合適的抗體用量。
孵育條件
通常使用2-8°C或冰上避光孵育30-60 min的條件，抗體結(jié)合和溫度有關(guān)，在冰上染色可能需要更長的孵育時間。可以根據(jù)染色效果優(yōu)化孵育溫度和時間。
抗體染色的具體流程
將準備好的樣本置于冰上待用。
將推薦量的各種一抗在適當體積的流式細胞術(shù)染色液中混合并加入細胞中，使最終的染色體積為100 μL（即50 μL細胞樣品 + 50 μL抗體混合物），或者直接向含有細胞的100uL體系中分別加入所需量的抗體，輕輕地脈沖渦旋混合。
2-8°C或冰上避光孵育30至60 min。
加入1 mL流式細胞術(shù)染色液洗滌細胞，在室溫下400-600 x g離心5分鐘， 棄上清。
重復上一步。
[可選]如果染色當天無法上機檢測，可以將100 μL樣品與100 μL IC固定液（貨號00-8222-48）混合，從而將樣品保存在IC固定液中；或者加入1步固定/裂解液（貨號00-5333-54）。樣品在這些緩沖液中可于2–8°C避光保存3天。
將細胞重懸于合適體積的流式染色緩沖液中（可根據(jù)儀器要求以及經(jīng)驗靈活調(diào)整重懸的體積）。
第四步 細胞死活染色（可選）
如果僅做表面染色，不涉及胞內(nèi)靶標的染色，可使用7-AAD、PI、SYTOX系列等核酸染料進行死活染色，染色時根據(jù)說明書用量在上機前添加即可，無需洗滌。但是核酸類死活染料不兼容后續(xù)的樣品固定。此外，如果流式抗體偶聯(lián)NovaFluor染料，也不建議使用這類核酸染料。更多關(guān)于如何選擇合適的死活染料，請點擊下方圖片查看往期Dr.賽流式小課堂“流式可固定活性染料”，進一步了解更多內(nèi)容。
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我們完成了以上染色步驟，后續(xù)就可以對樣本進行上機檢測了。同樣，掃一掃下方二維碼，查看全血樣品的流式細胞表面染色步驟。
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Question & Answer
問
抗體染色涉及到大分子染料時，我應該使用何種buffer配制抗體呢？
答
在使用兩種或兩種以上的Super Bright?, Brilliant Violet?, Brilliant Ultra Violet?或其他聚合物染料偶聯(lián)的流式抗體時，請同時在染色體系中添加Super Bright Complete Staining Buffer（產(chǎn)品貨號：SB-4401-42）或Brilliant Stain Buffer（產(chǎn)品貨號：00-4409-75），以降低染料聚合導致的非特異性染色。
如果您使用了NovaFluor偶聯(lián)的流式一抗，請同時在100 μL染色體系中添加 5μL CellBlox Plus Blocking Buffer（貨號：C001T06F01）。在對巨噬細胞使用偶聯(lián)了花菁染料（Cyanine dye）的抗體染色時，也需在染色體系中添加這一Buffer。
問
沒有熒光直標的流式抗體怎么辦？
答
對于沒有熒光直標的流式抗體，有以下幾種解決方案：
（1）選擇一款熒光標記的二抗，此時需要考慮二抗與一抗的種屬和亞型搭配。如果做多重染色，則需要同時注意該二抗不會識別其它直標的流式一抗。
（2）如果是生物素標記的一抗，可以使用熒光標記的鏈霉親和素。
（3）自行將流式抗體標記熒光基團。賽默飛有可用于標記抗體的試劑。如果您在選擇方面有疑問，請點擊下方圖片查看往期抗體標記試劑盒選擇攻略！
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流式細胞術(shù)是重要的細胞分析方法學，賽默飛世爾科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific產(chǎn)品品牌可提供從流式儀器到抗體和試劑的流式整體解決方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴著每一代流式科學家和技術(shù)人員獲得成果、共同成長，這些年來我們一起見證以Anti-FoxP3為代表的流式抗體深受喜愛、更多種類的流式熒光染料欣然上市以及現(xiàn)在有著更豐富的產(chǎn)品和工具，滿足高校研究院、生物技術(shù)公司、藥企等從早期基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)等不同階段的需求，加速生命科學行業(yè)的進程發(fā)展。
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