在 IHC 實(shí)驗(yàn)中，樣本制備往往被低估。組織的固定方式會(huì)直接影響蛋白結(jié)構(gòu)、抗原表位暴露以及抗體進(jìn)入組織的能力。

腫瘤研究中最常見(jiàn)的樣本形式有兩種：冷凍切片和石蠟包埋（FFPE）樣本。冷凍切片的優(yōu)勢(shì)是抗原保存較好，信號(hào)通常比較強(qiáng)，但組織結(jié)構(gòu)容易受損；而 FFPE 樣本則可以很好地保持組織形態(tài)，因此在病理和大量研究樣本中被廣泛使用，不過(guò)它也會(huì)帶來(lái)蛋白交聯(lián)的問(wèn)題。

如果在 IHC 中遇到染色非常弱甚至完全沒(méi)有信號(hào)，有時(shí)并不是抗體的問(wèn)題，而可能只是樣本處理出現(xiàn)了一些細(xì)節(jié)偏差，例如切片存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、組織在玻片上干燥，或者脫蠟步驟不徹底。這些細(xì)節(jié)都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)于 FFPE 樣本來(lái)說(shuō)，抗原修復(fù)幾乎是不可避免的一步。福爾馬林固定會(huì)在蛋白之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而掩蓋抗原表位，使抗體難以結(jié)合。抗原修復(fù)的目的，就是重新暴露這些被隱藏的表位，使抗體能夠順利識(shí)別靶蛋白。

加熱是比較普遍的抗原修復(fù)方法，例如微波加熱、高壓鍋或者加熱緩沖液。不同的蛋白對(duì)修復(fù)條件并不相同，因此緩沖液的 pH、加熱時(shí)間以及溫度都可能影響最終結(jié)果。如果抗原修復(fù)條件不合適，就很容易出現(xiàn)染色弱或者染色不均勻的情況。

IHC 的一個(gè)經(jīng)典問(wèn)題是整張切片都是背景。這通常是因?yàn)榻M織中存在內(nèi)源性酶或非特異性結(jié)合。組織中天然存在的過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，如果在染色前沒(méi)有被抑制，就會(huì)參與顯色反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量背景信號(hào)。

因此，在抗體孵育之前進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆忾]處理非常重要。常見(jiàn)的方法包括使用H?O? 抑制過(guò)氧化物酶、正常血清封閉，或者使用親和素/生物素封閉體系。這一步雖然看似簡(jiǎn)單，但往往能顯著改善染色質(zhì)量。

文獻(xiàn)引用固然重要，但更關(guān)鍵的是抗體是否做過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證。高質(zhì)量抗體通常會(huì)通過(guò)多種方法驗(yàn)證，例如：基因敲除（KO），RNA干擾（KD），免疫沉淀/質(zhì)譜，正交驗(yàn)證等，這些方法可以確保抗體真正識(shí)別目標(biāo)蛋白。

最后，這幾年越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始使用重組抗體。原因其實(shí)很簡(jiǎn)單：穩(wěn)定。傳統(tǒng)雜交瘤抗體有一個(gè)問(wèn)題：不同批次之間可能存在差異。而重組抗體通過(guò)已知序列表達(dá)，通常具有更好的批次一致性、更穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果甚至更高的特異性。

當(dāng)抗體成功結(jié)合靶蛋白之后，接下來(lái)就是顯色步驟。IHC 中最經(jīng)典的顯色體系是 HRP 與 DAB 組合。對(duì)于表達(dá)量較低的蛋白，還可以使用增強(qiáng)型 DAB 顯色體系。

在完成染色后，顯微鏡成像同樣需要注意一些細(xì)節(jié)，例如物鏡是否清潔、封片劑是否與顯色體系兼容、濾光片是否正確設(shè)置等。這些因素看似微小，但都會(huì)影響最終圖像質(zhì)量。