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PlasmidSelect質(zhì)粒親和層析機(jī)理淺析

來源：Cytiva（思拓凡） 更新時(shí)間：2024-08-08 09:44:00 閱讀量：689
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質(zhì)粒 (plasmid DNA, pDNA) 作為非病毒載體，低免疫原性、無毒，可直接用于基因治療或DNA疫苗[1]，因此制備出符合法規(guī)要求的高純度、治療級質(zhì)粒DNA，變得尤為重要。另外，pDNA也可以用于包裝病毒顆粒，作為中間原料。本文將重點(diǎn)介紹pDNA的性質(zhì)、親和配基改造、純化策略和新應(yīng)用。



質(zhì)粒pDNA簡介



天然質(zhì)粒為200 bp~100,000 bp大小，存在于原核及（某些）真核細(xì)胞中[2, 3]，其攜帶的基因?qū)τ谒拗鞣潜匦?，但可以更好地適應(yīng)生存環(huán)境，如抗生素抗性、代謝特殊分子（如芳香族化合物）等。作為載體工具的質(zhì)粒一般小于10,000 bp[4]，由復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)及其它元件（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯表達(dá)元件和蛋白標(biāo)簽）組成。

pDNA主要有三種拓?fù)湫螒B(tài)：超螺旋、開環(huán)、和線性結(jié)構(gòu)，及各自對應(yīng)的多聚形式，如圖1和圖2。


圖1：質(zhì)粒DNA的不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖[1]


圖2：pCMV-S2S (5.7 kbp) 質(zhì)粒DNA電鏡圖片（15,000倍放大）[4]


超螺旋質(zhì)粒 (supercoiled, sc pDNA) ：又叫共價(jià)閉環(huán)雙鏈DNA (ccc DNA) ，是雙鏈DNA在旋轉(zhuǎn)酶gyrase的催化下，像扭麻花一樣將自身纏繞形成（負(fù)）超螺旋，結(jié)構(gòu)最為緊湊，利于在細(xì)胞的狹小空間內(nèi)存儲大量遺傳信息。sc pDNA最為完整、穩(wěn)定、有活性，轉(zhuǎn)染效率最高[5, 6]。

開環(huán)質(zhì)粒 (open circular, oc pDNA) ：如果sc pDNA的一條鏈發(fā)生斷裂，即為oc pDNA，由細(xì)菌生長過程中自然發(fā)生、UV照射、核酸酶催化斷裂、或提取等過程的機(jī)械損傷造成，并受到純化后儲存溫度的影響[7]。失去超螺旋纏繞結(jié)構(gòu)，形態(tài)松散。oc pDNA經(jīng)過內(nèi)切酶處理，可以變?yōu)榫€性pDNA。

線性質(zhì)粒 (linear pDNA) ：sc pDNA的兩條鏈在相鄰位置發(fā)生斷裂，或者經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切，即為linear pDNA。線性pDNA可以通過連接酶變?yōu)閛c pDNA[4]。

寡聚 (oligomer) 形式的串聯(lián)體 (concatemer) ：可以發(fā)生在上述三種結(jié)構(gòu)中，如圖1中的dimer形式，整個(gè)pDNA為一條鏈，酶切行為與單體一致。通常出現(xiàn)在質(zhì)粒復(fù)制后的同源重組過程[8]或復(fù)制過程當(dāng)中。pDNA的插入片段越大，則寡聚-單體比例越高[4]。2009年，Christof Maucksch等[9]研究了首尾相接的二聚體形式sc pDNA對真核細(xì)胞Jurkat cells的轉(zhuǎn)化及表達(dá)效率，結(jié)果表明，在電穿孔后，100%細(xì)胞表面都附著pDNA，但是由于單體 (4.7-kb, 80 nm) 和二聚體 (9.4-kb, 150 nm) pDNA在直徑上的差異，造成單體的轉(zhuǎn)染效率更高（相差1.3倍）。對于成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，二聚體的轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)效率卻比單體更高，推測是由于前面的基因拷貝帶著后面的拷貝一起被轉(zhuǎn)錄。

此外，pDNA還會(huì)發(fā)生互相纏繞 (intertwined) ，孤立的環(huán)狀雙鏈pDNA互鎖成鏈條形狀，也叫做catenanes（索烴，連環(huán)）[10]或concatenates[11]，仍為多條pDNA鏈。主要發(fā)生在質(zhì)粒復(fù)制過程中，DNA knot意外將DNA雙鏈交織在一起。這種結(jié)構(gòu)通常不出現(xiàn)在質(zhì)粒制備過程中，在體外使用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可以合成出來。

如果開環(huán)或線性pDNA的斷裂，發(fā)生在啟動(dòng)子或基因編碼區(qū)，將造成質(zhì)粒無效。因此，需要分離出完整、具有功能活性的sc pDNA[12]。作為基因治療和DNA疫苗的藥用pDNA，不同法規(guī)要求sc pDNA含量FDA[13]：>80%，NMPA：≥90%。

不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)pDNA性質(zhì)有別并影響其分離：

sc pDNA的電荷密度更高：pDNA所帶電荷主要來自骨架的磷酸基團(tuán)，不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)總電荷量相似。但由于sc結(jié)構(gòu)更加緊湊，電荷密度比oc更高[14, 15]，因此在離子交換層析中結(jié)合更強(qiáng)而晚洗脫[16]。此外，電荷強(qiáng)度也和序列組成（高A、T含量）等相關(guān)[17, 18]，影響離子交換選擇性，需要和其它層析方法聯(lián)用。

sc pDNA的堿基暴露程度更高：由于DNA為右手螺旋，而sc pDNA多為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)[19]，此時(shí)DNA雙鏈?zhǔn)悄鏁r(shí)針旋轉(zhuǎn)的，扭應(yīng)力（torsional tension，如纏繞的電話線）的存在，使得雙鏈DNA被部分解螺旋，實(shí)際上sc pDNA中雙鏈DNA的螺旋數(shù)量 (helical turns) 是少于開環(huán)和線性pDNA的[4]，因此造成堿基暴露更多[20, 21]，這種結(jié)構(gòu)利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程中DNA的解旋和鏈分離[22]。質(zhì)粒的親和或疏水層析中，通常會(huì)利用到不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的堿基暴露程度差異。

pDNA在宿主菌中的質(zhì)量占比不足3% (w/w) ，純化中除了開環(huán)和線性DNA之外，還有眾多雜質(zhì)，包括基因組DNA (gDNA) 在堿裂解后產(chǎn)生的片段、RNA、宿主蛋白HCP和內(nèi)毒素等，如表1。


表1 ：細(xì)菌裂解液組分構(gòu)成及質(zhì)粒純化雜質(zhì)限度要求[26]


其中，gDNA和RNA的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒類似[12]，內(nèi)毒素 (pI≈2) [24]和質(zhì)粒同為強(qiáng)負(fù)電性[25]，都對純化造成挑戰(zhàn)。


表2：不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的pDNA和宿主雜質(zhì)，在理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)上的相似性[23]


質(zhì)粒的親和層析



質(zhì)粒的親和層析，多基于生物學(xué)互作或化學(xué)結(jié)構(gòu)，如固相金屬離子層析 (IMAC) 、三螺旋親和層析 (THAC) 、蛋白-DNA親和互作、氨基酸-DNA親和互作等。其中，前三種方式都無法有效去除gDNA，以及區(qū)分sc和oc的構(gòu)象[27]。

氨基酸作為小分子親和配基，是基于天然存在的生物學(xué)互作關(guān)系，通過原子結(jié)構(gòu)研究，選擇和特定的核苷酸堿基優(yōu)先發(fā)生互作的氨基酸作為配基。常見的氨基酸，如精氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和賴氨酸等，都可以用于pDNA純化，可謂一場盛宴，如表1。


表3：報(bào)道中用于pDNA親和層析的氨基酸配基舉例。（氨基酸結(jié)構(gòu)引自chem.libretexts.org）

氨基酸配基

化學(xué)式

和質(zhì)粒互作機(jī)理

精氨酸

Arginine

氫鍵（主要和G）、靜電互作[28]

、弱脂肪側(cè)鏈?zhǔn)杷?sup>[34]提高NaCl濃度洗脫或使用精氨酸競爭性洗脫[20]。

賴氨酸

Lysine

氫鍵（主要和G）、靜電互作

、弱脂肪側(cè)鏈?zhǔn)杷愃凭彼幔?sup style="font-size: 9px;">[29]。提高NaCl濃度洗脫。

組氨酸

Histidine

氫鍵、環(huán)堆積 (ring stacking) /疏水以及水介導(dǎo)的氫鍵[21]。降低硫酸銨 (AS濃度) 洗脫。

芳香族色氨酸

L-tryptophan

主要為疏水互作，π-π stacking；另外，和特殊氨基酸之間的氫鍵、和pDNA骨架之間的離子互作也不能忽視，因?yàn)?0度低溫也可以結(jié)合[30, 31]。降低AS濃度洗脫。

芳香族酪氨酸

L-tyrosine

主要為疏水互作，π-π stacking；另外，和特殊氨基酸之間的氫鍵，和pDNA骨架之間的離子互作，同上[31]。降低AS濃度洗脫。


精氨酸-堿基互作，出現(xiàn)在眾多蛋白-DNA互作結(jié)構(gòu)中，最為普遍[32]。如圖3所示，精氨酸傾向于和鳥嘌呤之間發(fā)生互作（體現(xiàn)出序列偏好）[33]，為雙配位基 (bidentate) 模式，形成兩個(gè)氫鍵（電子供體-受體為：氫-氮、氫-氧）?；プ靼l(fā)生在精氨酸和堿基之間，而sc pDNA的堿基暴露更加充分，且超螺旋形式讓核苷酸之間的距離更近從而促進(jìn)多點(diǎn)結(jié)合[27]，因此精氨酸親和可以分離sc和oc pDNA。精氨酸的pKa為12，在接近中性pH條件下帶正電荷，和帶負(fù)電荷的pDNA之間還存在靜電互作[28, 34]。因此可以通過添加精氨酸競爭性洗脫或拉NaCl梯度[34]。


圖3：精氨酸和鳥嘌呤互作示意圖，箭頭指示電子供體到受體的方向。（紅色是氧，淡藍(lán)色是碳，深藍(lán)色是氮，黃色是氫）[27]


但是，氨基酸作為pDNA親和配基，選擇性較差[32, 33]、載量和收率[20]較低、需要更高的鹽濃度（如3M硫酸銨）促進(jìn)結(jié)合，有待進(jìn)一步優(yōu)化。



PS配基開發(fā)-眾里挑一



PlasmidSelect (PS) 為基于苯丙氨酸優(yōu)化而來[26]，苯丙氨酸參與某些雙鏈DNA互作中[35, 36]。例如，抗癌藥物順鉑破壞DNA結(jié)構(gòu)，形成鏈內(nèi)d (GpG) 和d (ApG) 交聯(lián)[37]，造成DNA雙螺旋彎曲成L形并部分解旋，這種DNA結(jié)構(gòu)會(huì)招募HMG結(jié)構(gòu)域蛋白[38]，從而介導(dǎo)藥物的抗癌活性。X射線晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，HMG蛋白37位的苯丙氨酸和雙鏈DNA (G8, G9) 之間存在氫鍵和疏水互作，將其突變成丙氨酸后互作顯著減弱[39]。

基于苯丙氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，2003年Lemmens等[40]發(fā)表文獻(xiàn)，最早開發(fā)了用于質(zhì)粒親和純化的嗜硫親和配基，用于分離sc和oc pDNA。


圖4：不同配基用于質(zhì)粒DNA嗜硫親和層析結(jié)果圖[40]


如圖4，堿裂解后的pUC19質(zhì)粒 (6125 bp) 首先經(jīng)過Sepharose 6 FF組分分離去除RNA等低分子量雜質(zhì)干擾，并置換到2 M硫酸銨 (AS) 中，將此含有sc和oc pDNA的樣品，上柱純化。對于圖a、b、c的配基，oc pDNA穿透，sc pDNA掛柱并在AS濃度下降過程中一早洗脫下來（圖a即為PlasmidSelect，2-巰基吡啶）。對于圖d、e、f的配基，oc和sc pDNA都不結(jié)合，全部穿透。因此，對于質(zhì)粒結(jié)合，配基需要含有芳香環(huán)（因此圖d不結(jié)合）和至少一個(gè)硫醚結(jié)構(gòu)（因此圖e、f不結(jié)合），這也暗示了兩種互作機(jī)理的存在：

 1 

含氮芳香環(huán)：參與到與sc pDNA之間的插入式π-π 疏水互作 (intercalating hydrophobic π-π type of interaction) [40]。

 2 

硫醚：推測硫作為電子供體，參與到和特定核苷酸之間的電荷轉(zhuǎn)移 (charge transfer) [40]。

實(shí)際上，供電基團(tuán)并非越多越好，例如在芳香環(huán)側(cè)鏈取代上更多的硫、氧和氮，或者最多兩個(gè)鹵素，即加入更多的供電基團(tuán)，會(huì)增強(qiáng)pDNA和配基之間的互作，同樣為2 M AS時(shí)oc pDNA掛柱占據(jù)載量，同時(shí)sc pDNA洗脫電導(dǎo)需要進(jìn)一步降低[40, 41]。另外，由于結(jié)合太強(qiáng)，無法優(yōu)化為維持2M AS的同時(shí)拉NaCl梯度洗脫，不利于內(nèi)毒素等雜質(zhì)的去除。上圖C配基的結(jié)構(gòu)也有同樣情況[40]。

上述兩種互作模式都和堿基相關(guān)，因此對于堿基暴露更充分的sc pDNA具有高選擇性。嗜硫親和作用的存在，使得PS的選擇性（分辨率）高于普通的疏水層析[42]。

PS結(jié)合緩沖液中硫酸銨，作為溶致鹽 (lyotropic salt) ，有效奪取樣品表面的有序水，促進(jìn)疏水吸附。洗脫時(shí)：

 1 

單獨(dú)拉AS梯度進(jìn)行洗脫，直至水。sc pDNA和痕量內(nèi)毒素會(huì)發(fā)生共洗脫而不利于雜質(zhì)去除。

 2 

有趣的是，在維持高濃度AS (~2 M) 的情況下，僅通過增加NaCl濃度梯度（0-2 M過程中），即可以先后洗脫oc和sc pDNA（二者大部分堿基隱藏在內(nèi)部，相對低疏水性[43]）；繼續(xù)提高NaCl濃度至3M飽和濃度，也無法洗脫殘留的RNA（堿基暴露更加充分）、內(nèi)毒素（Lipid A區(qū)疏水）及某些疏水性質(zhì)蛋白。這些雜質(zhì)因?yàn)槭杷愿鼜?qiáng)，只能通過降低AS濃度來洗脫。


圖5：PlasmidSelect用于質(zhì)粒親和層析結(jié)果圖


圖5為PlasmidSelect親和層析經(jīng)典圖，經(jīng)過Sepharose 6 FF分子篩組分分離的pUC19樣品中，摻入堿裂解粗樣品（含RNA）和2.5 ug/mL熒光標(biāo)記的內(nèi)毒素，并將硫酸銨AS濃度調(diào)整至2.25 M。使用PlasmidSelect進(jìn)行質(zhì)粒分離，在維持2.25 M AS的情況下，僅拉NaCl梯度進(jìn)行質(zhì)粒洗脫（虛線為電導(dǎo)，實(shí)線為OD 260 nm）。

平衡階段，非核酸類雜質(zhì)穿透；

0-2 M NaCl梯度過程中，oc pDNA先洗脫（圖4為2M AS，oc pDNA為穿透），sc pDNA后洗脫；

繼續(xù)降低AS梯度至水的過程中，RNA、內(nèi)毒素（點(diǎn)線，柱狀折線圖）以及某些蛋白雜質(zhì)才被洗脫下來。

PlasmidSelect可以通過NaCl梯度進(jìn)行洗脫，提示可能還存在離子對互作 (ion-pair interactions) [40]。增加配基上親水的供電基團(tuán)可以提高對oc和sc的分辨率，這可能由于親水性的增加，促進(jìn)了配基和磷酸骨架之間互作[41]。類似表3中的芳香族氨基酸。因此，從層析行為上，PS更加類似復(fù)合模式配基。



質(zhì)粒純化策略



基于PlasmidSelect的高選擇性，開發(fā)了經(jīng)典的質(zhì)粒純化三步法[44]，適用于實(shí)驗(yàn)室到GMP級別放大。隨著技術(shù)革新，基于PS的兩步法也悄然興起，并被 Fast Trak中國成功開發(fā)[45]。


圖6：質(zhì)粒純化工藝路線


三步法解析：

通常，和pDNA理化性質(zhì)非常接近的RNA會(huì)被首先去除，避免占據(jù)后續(xù)步驟載量或造成聚集堵塞[26]。前述Sepharose 6 FF分子篩為經(jīng)典方法，在~2 M硫酸銨AS（效果最佳）的高鹽條件下，RNA發(fā)生明顯皺縮 (compacting) ，結(jié)構(gòu)更加緊湊，可以充分進(jìn)入填料孔隙中，走內(nèi)水；pDNA因?yàn)槠涑菪Y(jié)構(gòu)受AS影響較小，從而被排阻。研究中AS濃度需要控制在1.5-2.7 M范圍內(nèi)并銜接下一個(gè)層析步驟：完全不加鹽會(huì)造成RNA和pDNA出峰重疊，高于2.7 M AS則會(huì)造成pDNA同樣發(fā)生皺縮而進(jìn)入填料孔隙中[26]。該步驟目前可以替換為Capto Core 700復(fù)合模式填料，5 μm的鈍化外殼用于尺寸排阻，內(nèi)部的復(fù)合模式辛胺配基用于結(jié)合雜質(zhì)；前面也可以加一步沉淀去除大部分RNA，提高對雜質(zhì)的載量[45]。RNA還可以通過CaCl2[46]或硫酸銨[47]沉淀法去除，但收率、純度和穩(wěn)健性往往不高。

PlasmidSelect (PS) 作為中純或精純，為上好方案，可以有效分離oc和sc pDNA，對于3–14 kb質(zhì)粒都適用[40]。由于PS親和的解離過程動(dòng)力學(xué)比較慢 (slow kinetics of the elution) ，在PS洗脫過程中建議增加孵育時(shí)間，提高樣品收率[26]。最新產(chǎn)品Capto PlasmidSelect載量≥ 3.0 mg超螺旋質(zhì)粒/mL。針對不同pDNA樣品，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。該步驟也可以替換為疏水層析如 Capto Phenyl ImpRes（苯基），但如前所述，其選擇性不如PS。

經(jīng)典三步法的最后還有一個(gè)離子交換，去除剩余少量雜質(zhì)，如內(nèi)毒素以及痕量RNA、gDNA等，并置換buffer以去除AS。由于binding buffer為0.4 M的NaCl，絕大部分內(nèi)毒素穿透[40]，可能極少量殘留在柱子上有待CIP去除[26, 48]。該步驟也可以拉線性梯度。填料已經(jīng)由合成骨架Source 30Q，升級為收率更高的剛性瓊脂糖骨架Capto Q ImpRes。還可以嘗試復(fù)合模式填料Capto adhere，或使用膜層析Mustang Q[49]提高通量。



PlasmidSelect用于質(zhì)量鑒定



sc pDNA和oc pDNA的分析，通常使用瓊脂糖凝膠電泳 (AGE) 、毛細(xì)管電泳法 (CGE) 或HPLC。

根據(jù)樣品的出峰順序，樣品的移動(dòng)速率在AGE膠上主要由分子大小決定（各種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的單體在dimer前面，如圖7），而在CGE中則主要由拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)決定（單體和聚體的出峰順序都是依次為sc、oc、linear pDNA，如圖8）[4]。


圖7：不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)pUC19瓊脂糖凝膠電泳圖。[4]


 圖8：不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)pUC19毛細(xì)管電泳峰圖。[4]


AGE分辨率有限，難以區(qū)分超螺旋二聚體和開環(huán)單體（可以進(jìn)行特殊酶解）[50]，受電泳條件影響較大，且定量不準(zhǔn)確。CGE因其高分辨、靈敏度及重復(fù)性，被建議用于質(zhì)粒的質(zhì)控過程和定量[4]。

質(zhì)粒DNA的HPLC分析，一般使用離子交換（如 Source 15 PHE column[43]）或疏水層析[51]。PlasmidSelect也可以用于pDNA的快速定性分析[52]，使用分子篩進(jìn)行組分分離后，即可上柱。


圖9：HiTrap PlasmidSelect Xtra用于質(zhì)粒定性。[52]



寡核苷酸純化



隨著基因治療的發(fā)展，對于更長片段的oligonucleotides純化，單一的離子交換層析分辨率不足。Capto PlasmidSelect可以和雙鏈DNA發(fā)生互作，被成功用于三苯甲基修飾全長oligo和失敗片段的分離（圖10），加一步Capto Q ImpRes作為精純（pH 12，結(jié)合洗脫模式），最終收獲oligo純度高于98%[53]。


圖10：三苯甲基修飾D84-mer全長片段和失敗片段的分離。梯度為1.75 – 0 M硫酸銨，20 CV ，buffer含50 mM Tris，pH 7.5。Load：10 mg oligo/mL resin，RT=6 min，分段收集。



純化IgM



嗜硫親和也常見于蛋白純化，特殊抗體親和柱HiTrap lgM Purification[54]和HiTrap lgY Purification[55]，同樣為2-巰基吡啶配基。由于預(yù)裝柱體積小，放大時(shí)，可以選擇Capto PlasmidSelect進(jìn)行純化。IgM由于為五聚體結(jié)構(gòu)，其填料配基密度相對更低，通過簡單調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件即可使用PS成功放大。更多問題，歡迎撥打智薈專線400-810-9118，轉(zhuǎn)2號線。


PlasmidSelect用于質(zhì)粒純化兩步法及寡核苷酸純化，請掃描二維碼，下載資料。








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