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保存手動運行的實驗結(jié)果

正確操作步驟：

點擊工具欄Manual→Execute Manual Instructions在打開Manual instructions對話框中選擇Save result as后的Browse按鈕，選擇要保存的路徑及名稱，點擊OK。

圖1 保存結(jié)果

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層析柱平衡

點擊工具欄Manual→Execute Manual Instructions→Alarm，根據(jù)層析柱參數(shù)，設(shè)置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure（本案例均設(shè)為0.5 MPa），點擊Insert；如有Alarm delta column pressure則進(jìn)行設(shè)置。

圖2 設(shè)備與系統(tǒng)連接

點擊Flow Path→Column position，在下拉框選擇柱子連接的位置；在Flow Direction復(fù)選框，選擇溶液流向（一般選Down flow自上向下運行），點擊Insert；如無柱位閥則無需進(jìn)行設(shè)置。

圖3 設(shè)置柱位和流向

點擊Pumps→System flow，輸入柱子推薦流速（如HiTrap Capto Q, 1mL層析柱推薦流速為1 mL/min），同時設(shè)置管路A1，點擊Insert→Execute。

圖4 設(shè)置流速和管路

點擊Monitor→Wavelength，選擇需要監(jiān)測的波長，點擊Insert→Execute；無需使用的波長，勾選后面的Off復(fù)選框關(guān)閉即可。（注意：單波長設(shè)備或僅需280 nm檢測時，可跳過此步）。

圖5 設(shè)置監(jiān)測波長

點擊Execute，系統(tǒng)開始運行，層析柱進(jìn)入平衡狀態(tài)，此時Process Picture中會以綠色標(biāo)識運行流路。

圖6 實驗運行界面

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上樣、沖洗及洗脫

在上樣閥的LoopF和LoopE口，連接樣品環(huán)（如0.5 mL）。

用注射器抽取緩沖液，連接到上樣閥的Syr口，推入緩沖液清洗樣品環(huán)，可重復(fù)幾次，確保清洗徹底。

清洗完成后，用注射器吸取樣品（重點：吸取的樣品體積必須大于上樣環(huán)體積）。

排除注射器內(nèi)的氣泡，將注射器連接到上樣閥的Syr口，推入樣品（重點：推入體積稍大于上樣環(huán)體積，確保無氣泡）。

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Monitors→Auto zero UV，點擊Insert。

圖7 紫外清零

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Injection valve，將上樣閥選擇為Inject，點擊Insert→Execute。

圖8 插入進(jìn)樣閥Inject命令

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Fraction collector F9-R→Fractionation，設(shè)置Fraction size為1 ml，點擊Insert→Execute。

注：收集命令可根據(jù)目的分子的性質(zhì)，實驗采用流穿模式或結(jié)合洗脫模式在不同步驟選擇收集。

圖9 插入收集命令

上樣運行1.5 ml后，點擊Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Manual load，將上樣閥切回Manual load，點擊Insert→Execute。

圖10 插入進(jìn)樣閥Manual load命令

繼續(xù)以1 mL/min的流速運行5 CV來沖洗雜質(zhì)。

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→選擇洗脫使用B液濃度target為100%，洗脫時間length為20 min（可根據(jù)流速選擇梯度時間，初次實驗推薦0-100% B , 20 CV），點擊Insert→Execute。

圖11 插入洗脫命令

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→選擇洗脫使用B液濃度target為100%，洗脫時間length為0 min，點擊Insert→Execute。運行5 CV。

圖12 插入柱沖洗命令

點擊Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→將B液濃度的target改為0%，洗脫時間length為0 min，點擊Insert→Execute。運行5 CV。

觀察儀器界面，待紫外峰與電導(dǎo)峰均平穩(wěn)，點擊工具欄中的結(jié)束圖標(biāo)，停止實驗即可。

將緩沖液A1的入口放入去離子水中，執(zhí)行Pump wash命令。點擊工具欄Manual Execute Manual Instructions→Alarm，分別設(shè)置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure為0.5 MPa和0.5MPa，點擊Insert。

點擊工具欄Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Column position，在下拉框中選擇柱子需要連接的位置，在Flow Direction復(fù)選框中選擇溶液流向Down flow或者是Up flow（一般選擇Down Flow，自上向下運行），點擊Insert；如無柱位閥則無需進(jìn)行設(shè)置。

點擊工具欄Manual→Execute Manual Instructions →Pumps→System flow，輸入層析柱推薦的流速為1 mL/min，點擊Insert。

點擊Execute一起執(zhí)行相應(yīng)的命令，即可開始用水清洗層析柱，運行2個柱體積之后，點擊工具欄暫停圖標(biāo)，暫停。

將緩沖液A1的入口放入經(jīng)脫氣的20%乙醇中，繼續(xù)運行，再次執(zhí)行Pump wash命令。

待泵沖洗結(jié)束后，機(jī)器會自動繼續(xù)之前1 ml/min的流速，用20%乙醇溶液清洗柱子，運行2個柱體積后，完成層析柱的保存。

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修改Method Settings中參數(shù)。點擊Method Phase下的Method setting, 即可進(jìn)入Method setting界面設(shè)置。在界面選擇Column type為HiTrap Capto Q，1 mL，選擇之后系統(tǒng)會自動出現(xiàn)該層析柱的Column Volume, pressure Limit pre- column，Pressure Limit delta- column，F(xiàn)low Rate等參數(shù)。Column Position選擇層析柱連接的柱位，如下圖選擇3號位。在Monitor setting處根據(jù)需求選擇需要檢測的紫外波長，系統(tǒng)默認(rèn)使用280 nm檢測，如需開其他波長（如260 nm）, 可勾選UV2，并輸入相應(yīng)波長即可。根據(jù)層析柱和設(shè)備的不同配置設(shè)置參數(shù)，如無柱位則無需設(shè)置。

圖15 Method Settings界面

點擊Equilibration進(jìn)入平衡階段設(shè)置，平衡流速、緩沖液入口不變，平衡時緩沖液B所占的比例為0%，輸入平衡體積5 CV。

圖16 Equilibration界面

點擊Sample Application進(jìn)入上樣階段設(shè)置，選擇Loop type為Capillary loop，輸入Empty loop with（清空樣品環(huán)）的體積1.5 ml（此方法使用0.5 mL樣品環(huán)，設(shè)置3倍樣品環(huán)體積為了完全清空樣品環(huán)內(nèi)樣品）。

圖17 Sample Application界面

點擊Column Wash進(jìn)入柱沖洗階段設(shè)置，選擇沖洗使用B液濃度0%，沖洗的溶液體積為5 CV。

圖18 Column Wash界面

點擊Elution進(jìn)入洗脫設(shè)置，保持洗脫流速、緩沖液入口以及緩沖液流向不變。設(shè)置使用線性洗脫，在20 CV之內(nèi)B濃度升至100%，并在Fractionation Setting中選擇Fraction Collector用收集器進(jìn)行固定體積收集，每管收集1 mL。

圖19 Elution界面

點擊Column Wash進(jìn)入下一步柱沖洗階段設(shè)置，此階段目的是對層析柱進(jìn)行徹底清洗。 設(shè)置清洗緩沖液為100% B，沖洗體積為5 CV。

圖20 Column Wash界面

點擊Equilibration進(jìn)入層析柱再平衡階段設(shè)置，此階段目的是將層析柱中的緩沖液置換為平衡緩沖液。設(shè)置平衡體積為5 CV。

圖21 Equilibration界面

保存編輯的方法點擊工具欄上保存圖標(biāo)（如下圖），在彈出的窗口中選擇存儲位置及名稱，點擊Save即可保存方法。

圖22 保存界面

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點擊工具欄Manual→Execute Manual Instructions→Pumps→System flow, 輸入層析柱推薦的流速為1 mL/min，點擊Insert并點擊Execute執(zhí)行。

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將層析柱從設(shè)備上拆下（拆柱過程需要先拆下端，后拆上端，擰下接頭后及時用堵頭堵上）。

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點擊Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Outlet valve，在下拉框中選擇出口為Frac，點擊Insert之后點擊Execute執(zhí)行，以清洗出口閥至收集器的管道。

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運行一段時間（約2-3 min即可）后點擊工具欄的結(jié)束圖標(biāo)， 結(jié)束層析柱及系統(tǒng)的清洗和過程。

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