在免疫組織化學（IHC）實驗的標準操作流程里，封閉是必做的一步。我們習慣于在一抗孵育前，用山羊血清（與二抗同源）或BSA對組織切片進行處理。其理論依據(jù)是：內(nèi)源性Fc受體會與抗體的Fc段結(jié)合，引發(fā)非特異性染色。然而，這一被廣泛接受的“常識”，卻鮮有研究去驗證其真?zhèn)巍?/p>

2011年，德國漢堡血液病理學研究所的團隊在Scientific Reports上發(fā)表了一項令人深思的文章。他們通過嚴謹?shù)膶φ諏嶒炞C實：常規(guī)固定后的細胞與組織樣本中，內(nèi)源性Fc受體已喪失結(jié)合抗體Fc段的能力，同時離子與疏水相互作用亦不會引發(fā)抗體非特異性結(jié)合。因此，免疫組化中傳統(tǒng)的山羊血清、BSA封閉步驟是非必要的，省略該步驟后：

不會產(chǎn)生背景染色

不影響特異性染色

可節(jié)省實驗成本與時間

「IHC診斷室」第9期，我們一起來學習這篇文章，結(jié)合實驗結(jié)果，共同探討免疫組化IHC操作中是否需要封閉步驟呢？質(zhì)疑的起點：一個找不到源頭的“常識”

抗體非特異性結(jié)合導致背景染色，這一觀點在學術(shù)界流傳已久。Fc受體（Fc receptors, FcRs）是識別抗體Fc段并介導多種效應功能的關(guān)鍵分子，理論上確實可能在IHC檢測中與抗體發(fā)生結(jié)合。盡管有大量的文獻提到這一觀點，但是研究團隊卻無法追溯到其原始出處。

更讓研究團隊感到費解的是目前的封閉策略。常規(guī)封閉是使用二抗來源種屬的5-10%正常血清進行孵育，以阻斷抗體與Fc受體的非特異性結(jié)合。他們認為這一做法存在邏輯漏洞：很多研究已證實山羊血清根本無法與人類細胞表面的Fc受體結(jié)合，然而在人類組織免疫檢測中，絕大多數(shù)的二抗源自山羊。

盡管如此，針對Fc受體或離子、疏水作用介導的非特異性背景進行封閉，仍被視作一抗孵育前不可跳過的環(huán)節(jié)。幾乎所有抗體制造商和知名免疫組化平臺（如IHC WORLD）的標準操作流程中，都包含了封閉步驟。這種“約定俗成”與科學證據(jù)之間的鴻溝，促使研究團隊展開了系統(tǒng)性的驗證。

實驗設計：用數(shù)據(jù)說話

為多維度評估封閉步驟的實際效用，研究團隊設計了涵蓋多種樣本類型和檢測方法的實驗方案：

樣本類型：冷凍與石蠟包埋組織切片、細胞培養(yǎng)單層、細胞離心涂片

固定與修復：用于石蠟包埋的組織樣本用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定。切片厚度為4μm，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟后，在家用蒸鍋中于95℃在10mM檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）中加熱30分鐘進行抗原修復。冰凍組織切片、細胞單層、血細胞涂片和細胞離心涂片用4%甲醛、甲醇或丙酮固定后進行免疫染色。

封閉處理：5%-10%正常山羊血清或1% BSA，對照組省去封閉步驟。

抗體體系：研究使用了45種小鼠單抗和兔多抗，所有抗體均按照說明書的建議使用。一抗的終濃度在1-5 μg/mL。明場染色采用HRP檢測系統(tǒng)，熒光顯色使用與Cy3、Alexa Fluor-488、Alexa Fluor-647等偶聯(lián)的山羊二抗。二抗的終濃度在5-10 μg/mL。

實驗結(jié)果采用盲法評估，由三名科研人員獨立判讀相鄰切片（封閉組vs未封閉組）的染色差異。

結(jié)果呈現(xiàn)：顛覆認知
1、組織切片無差異

經(jīng)常規(guī)固定（甲醛、丙酮、酒精）的人體組織樣本中，省略封閉步驟后，所有抗體均未出現(xiàn)非特異性結(jié)合導致的背景染色。具體為：

冷凍切片：人腎臟毛細血管內(nèi)皮（CD34）、胰-腺癌（CK8/18/19）、腎臟動脈壁（α-SMA）均未出現(xiàn)非特異性染色，背景干凈。

石蠟切片：人扁桃體（CD20）、腦星形細胞瘤（GFAP）、炎性骨組織（Col IV）同樣未出現(xiàn)非特異性結(jié)合。

特別值得注意的是，富含膠原的組織（如血管中膜、骨組織）常被擔憂會因IgG與堿性基團結(jié)合而產(chǎn)生背景，但實驗中各類膠原豐富的樣本均未出現(xiàn)假陽性信號。

經(jīng)常規(guī)固定后未進行封閉步驟，IHC沒有非特異性染色。a-c為冷凍組織切片，分別為人腎臟毛細血管內(nèi)皮（CD34）、人胰-腺癌（CK8/18/19）和人腎臟動脈壁（α-SMA），d-f為石蠟組織切片，分別為人扁桃體（CD20）、人腦星形細胞瘤（EFAP）、炎性骨組織（Col IV）。

2、Fc受體富集組織：關(guān)鍵驗證

Fc受體主要在單核細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和血小板表達，研究人員對這些細胞豐富的骨-髓、脾-臟、扁桃體和血細胞樣本進行重點檢測。正如人扁桃體的CD20和骨-髓的CD20、CD61、CD68 IHC結(jié)果所示，未經(jīng)封閉的組織樣本中沒有觀察到非特異性染色，在陰性對照中也未觀察到。因此推斷，經(jīng)過常規(guī)固定后，內(nèi)源性Fc受體喪失了與IgG抗體Fc段結(jié)合的能力。

在常規(guī)固定的骨-髓標本中，省略封閉步驟后，所有抗體（CD20、CD61、CD68）未出現(xiàn)非特異性結(jié)合。a B淋巴細胞，b巨核細胞和血小板，c單核/巨噬細胞及樹突狀細胞。

3、多重染色：復雜體系驗證

為排除檢測系統(tǒng)的局限性，研究人員進一步采用多重熒光免疫染色進行驗證。結(jié)果顯示，無論是采用熒光染料偶聯(lián)抗體還是鏈霉素親和素抗體，進行單標或多重熒光免疫標記，省略封閉步驟均未產(chǎn)生非特異性染色。這一結(jié)果通過人乳腺鱗癌組織中的細胞角蛋白5（cytokeratin 5, CK5）、CK10、CK14的三重免疫熒光染色得到證實。

人乳腺鱗癌未經(jīng)封閉的CK5、CK10、CK14的免疫熒光三重染色結(jié)果。a CK14（Alexa 488，綠色通道），b CK10（Cy3，紅色通道），c CK5（Alexa 647，粉色通道），d合成圖像

4、實驗動物樣本：結(jié)果相同

雖然本次實驗主要針對人類患者的組織樣本，但IHC更多的樣本來自實驗動物，其中嚙齒類動物是常用的實驗材料。因此，研究人員對新生大鼠培養(yǎng)的心肌細胞、小鼠和大鼠的組織樣本，以及牛和豬的組織樣本進行了相同的免疫檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，省去封閉步驟不會產(chǎn)生非特異性背景染色。這一結(jié)果與人類細胞和組織樣本的一致。

實驗動物細胞及組織樣本未進行封閉的免疫組化染色結(jié)果。a新生大鼠心肌細胞（Desmin），b大鼠主動脈壁（α-SMA），c小鼠脾-臟（Ki67），d小鼠腸道（Ki67）

學術(shù)呼應：來自另一項獨立研究的支持

無獨有偶，2018年美國Kyathanahalli S. Janardhan團隊在Toxicol Pathol發(fā)表的綜述文章，進一步支持了這一觀點。其數(shù)據(jù)顯示，在小鼠脾-臟（PAX5）、小腸（Ki67）和腦組織（GFAP）切片中，無論是否進行封閉，均未出現(xiàn)非特異性染色，染色結(jié)果高度一致，視覺上難以區(qū)分。

甲醛固定的石蠟包埋組織切片中，使用血清或其它試劑進行封閉并非關(guān)鍵步驟。小鼠脾-臟（A、B）、小腸（C、D）、腦（E、F）切片分別用PAX5、Ki67和GFAP抗體進行染色，左側(cè)切片在一抗孵育前用10%正常血清封閉，右側(cè)切片未進行封閉。

結(jié)論與啟示：重新審視“標準操作”

本研究通過系統(tǒng)的對照實驗，得出了與主流觀點相悖卻證據(jù)充分的結(jié)論：

經(jīng)甲醛、丙酮或酒精常規(guī)固定后，內(nèi)源性Fc受體喪失與IgG抗體Fc段結(jié)合的活性；同時，固定后的樣本也不會發(fā)生由疏水作用或離子相互作用介導的非特異性結(jié)合。因此，免疫組化中的傳統(tǒng)封閉步驟并非必要。

更深層的啟示：這項研究提醒我們，實驗室中的“標準操作”可能源于歷史沿襲而非實證基礎。隨著抗體制備技術(shù)和免疫技術(shù)的發(fā)展，我們應以批判性思維審視每一個實驗步驟，或許能夠發(fā)現(xiàn)更多的優(yōu)化空間，節(jié)省實驗成本，加快科研進度。

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參考文獻：

1. Buchwalow et al. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci. Rep. 2011. DOI:10.1038/srep00028

2. Janardhan et al. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicol Pathol. 2018. doi:10.1177/0192623318776907