近日，吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院李亞男、張影團(tuán)隊(duì)在《Clinical Science》發(fā)表研究論文，該研究綜合運(yùn)用單細(xì)胞拉曼光譜（Single-cell Raman spectroscopy, SCRS）和外泌體代謝組學(xué)技術(shù)，深入解析了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, K.p.）感染極早期的宿主代謝重編程機(jī)制。

長(zhǎng)光辰英P300共聚焦拉曼光譜儀通過原位單細(xì)胞拉曼成像，在非標(biāo)記狀態(tài)下精準(zhǔn)捕捉了感染早期宿主細(xì)胞的脂質(zhì)代謝特征變化，為揭示外泌體介導(dǎo)的炎癥風(fēng)暴啟動(dòng)機(jī)制提供了關(guān)鍵代謝線索。

研究背景

肺炎克雷伯菌是引起重癥肺炎的主要病原體，其臨床危害巨大。盡管已有研究關(guān)注其致病機(jī)制，但關(guān)于該菌在感染極早期如何通過改變宿主代謝微環(huán)境來誘導(dǎo)劇烈炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)有檢測(cè)方法難以在單細(xì)胞水平原位捕捉宿主細(xì)胞的早期代謝改變，限制了對(duì)感染啟動(dòng)階段關(guān)鍵事件的認(rèn)識(shí)。為此，本研究引入單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)，在無需破壞樣本的條件下原位解析感染早期氣道上皮細(xì)胞的代謝重編程特征，并結(jié)合外泌體代謝組學(xué)與免疫學(xué)分析，系統(tǒng)闡明“病原體-代謝-免疫”軸在肺炎克雷伯菌早期感染中的致病機(jī)制。

研究方法

本研究首先利用肺炎克雷伯菌感染氣道上皮細(xì)胞（BEAS-2B）構(gòu)建體外感染模型。采用P300共聚焦拉曼光譜儀對(duì)感染組織進(jìn)行原位拉曼成像分析，利用細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的特征峰實(shí)現(xiàn)侵入宿主細(xì)胞的K.p.免標(biāo)記空間定位，并通過光譜熱圖分析感染后不同時(shí)間點(diǎn)宿主細(xì)胞的代謝特征變化。隨后，分離并純化感染源性外泌體，采用UHPLC-QTOF-MS進(jìn)行代謝組學(xué)分析，鑒定差異代謝物。通過外泌體與巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合免疫熒光染色、Western blot和qPCR等技術(shù)，評(píng)估外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化和內(nèi)皮屏障功能的影響。最后，利用體內(nèi)感染模型驗(yàn)證外泌體介導(dǎo)的炎癥損傷效應(yīng)。

結(jié)果

1. 單細(xì)胞拉曼光譜原位解析：感染誘導(dǎo)氣道上皮“脂質(zhì)堆積”

為了在單細(xì)胞水平上捕捉K.p.感染引起的早期生化改變，研究團(tuán)隊(duì)利用共聚焦拉曼光譜儀對(duì)感染組織進(jìn)行了原位成像分析。 研究利用細(xì)菌細(xì)胞壁特有的肽聚糖（Peptidoglycan）拉曼特征峰，實(shí)現(xiàn)了對(duì)侵入宿主細(xì)胞內(nèi)的K.p.進(jìn)行免標(biāo)記的空間定位，并與熒光標(biāo)記結(jié)果相互印證。光譜熱圖顯示感染部位在 838–870 cm1、1050–1134 cm1 和 1424–1502 cm1 波段的信號(hào)顯著增強(qiáng)。這些波段對(duì)應(yīng)于脂質(zhì)（Lipids）中的C-C、CH鍵以及多糖的糖苷鍵，意味著宿主代謝特征改變。這一結(jié)果直觀地揭示了K.p.侵染后，氣道上皮細(xì)胞發(fā)生了顯著的代謝改變，表現(xiàn)為脂質(zhì)和多糖成分的異常高表達(dá)。這為后續(xù)發(fā)現(xiàn)“富脂”外泌體的致病機(jī)制提供了關(guān)鍵的代謝線索。

圖1.革蘭氏陰性桿菌肺炎和肽聚糖的拉曼光譜分析

(A) 拉曼成像顯示兩個(gè)不同樣本（#1 和 #2）中的 FITC 標(biāo)記的肺炎克雷伯菌和肽聚糖。 (B) 兩個(gè)樣本（#1 和 #2）的明場(chǎng)和拉曼光譜圖像，顯示 FITC-K.p.的分布和相應(yīng)的拉曼位移。標(biāo)尺：10 μm。 (C) 感染后不同時(shí)間點(diǎn)（對(duì)照組、0.5、1、3 小時(shí)）肺組織中拉曼光譜變化的時(shí)程分析，相應(yīng)的免疫熒光圖像顯示 CK8 和 DAPI 染色。標(biāo)尺：10 μm。

2. “富脂”外泌體：連接上皮感染與血管損傷的信使

基于拉曼光譜發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)代謝異常，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步分離并分析了K.p.感染的BEAS-2B（人支氣管上皮細(xì)胞）來源的外泌體。 UHPLC-QTOF-MS分析顯示，感染源性外泌體中脂質(zhì)及類脂分子占比高達(dá)53.74%。差異代謝物分析進(jìn)一步鎖定磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）在感染組外泌體中顯著富集。這種富含磷脂酰膽堿的外泌體在被血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取后，導(dǎo)致緊密連接蛋白 ZO-1 和 Occludin 的表達(dá)顯著下調(diào)，直接破壞了血管內(nèi)皮屏障的完整性，增加了血管通透性。

圖2.肺炎克雷伯菌感染上皮細(xì)胞來源的囊泡代謝組學(xué)分析

(A) 外泌體代謝物組成，突出顯示脂質(zhì)和類脂分子是最豐富的類別，其次是有機(jī)酸及其衍生物。(B) 火山圖顯示與對(duì)照組相比，肺炎克雷伯菌感染外泌體中代謝物的顯著上調(diào)和下調(diào)。（n=3）。(C) 熱圖顯示 BEAS-2B 外泌體與肺炎克雷伯菌感染細(xì)胞外泌體之間代謝物的差異表達(dá)。(D) 代謝通路富集分析，在鞘脂和丙酮酸代謝中存在顯著結(jié)果。(E) 通路分析顯示脂質(zhì)相關(guān)代謝通路顯著富集，包括鞘脂和甘油磷脂代謝。(F) 前10種差異代謝物的VIP圖，突出顯示對(duì)組間差異有貢獻(xiàn)的代謝物。(G) 條形圖顯示與對(duì)照組相比，肺炎克雷伯菌感染外泌體中特定磷脂酰膽堿水平顯著增加，表明脂質(zhì)代謝增強(qiáng)。

3. 免疫調(diào)控機(jī)制：外泌體驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞M1極化與炎癥風(fēng)暴

在破壞物理屏障的同時(shí)，這些外泌體還充當(dāng)了免疫系統(tǒng)的“促炎劑”。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，感染源性外泌體能夠被巨噬細(xì)胞攝取，誘導(dǎo)其顯著上調(diào)iNOS 和 CD86 等M1型標(biāo)志物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎表型分化。機(jī)制研究表明，外泌體進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)了 NF-κB p65 的磷酸化及核轉(zhuǎn)位。NF-κB通路的激活進(jìn)一步促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子（TNF-α, IL-6）和趨化因子（CXCL1, CXCL2）的釋放。這些趨化因子隨后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能大量招募中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)肺部，導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。

圖3.克雷伯氏肺炎菌感染外泌體對(duì)內(nèi)皮屏障和巨噬細(xì)胞極化的影響

(A) 免疫熒光圖像顯示HUVEC細(xì)胞在經(jīng)肺炎克雷伯菌感染外泌體處理后 ZO-1 表達(dá)減少，表明緊密連接被破壞。標(biāo)尺：50 μm。(B) Western blot 分析比較對(duì)照組，量化 HUVEC 細(xì)胞與肺炎克雷伯菌感染外泌體共孵育后ZO-1和occludin表達(dá)的降低。**P<0.01, ***P<0.001（n = 3）。(C) Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示與肺炎克雷伯菌感染外泌體共培養(yǎng)時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)。標(biāo)尺：50 μm。(D) 與對(duì)照組相比，經(jīng)肺炎克雷伯菌感染外泌體處理的巨噬細(xì)胞形態(tài)變化，顯示更明顯的拉長(zhǎng)。標(biāo)尺：50 μm。(E-H) 巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的 qPCR 分析。CD86 和 NOS2 表達(dá)的增加表明極化向 M1 巨噬細(xì)胞發(fā)展，而 CD206 和 CD163 水平保持不變。**P<0.01, ****P<0.0001, ns：無顯著差異（n = 3）。

結(jié)論

本研究描繪了K.p.早期肺部感染的一條完整的“病原體-代謝-免疫”軸：

1.早期侵襲與代謝改變：K.p. 侵入氣道上皮細(xì)胞，拉曼光譜原位檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)和多糖的異常積聚；

2.外泌體釋放：受感染的上皮細(xì)胞釋放富含磷脂酰膽堿的外泌體；

3.雙重致病效應(yīng)：對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞， 破壞ZO-1/Occludin，瓦解血管內(nèi)皮屏障；對(duì)巨噬細(xì)胞，被吞噬后激活NF-κB信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)M1極化；

4.炎癥爆發(fā)：釋放趨化因子，招募中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致急性肺炎癥。

研究揭示了外泌體介導(dǎo)的磷脂酰膽堿傳遞是K.p.感染誘導(dǎo)炎癥風(fēng)暴的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，阻斷這一外泌體通訊或干預(yù)脂質(zhì)代謝可能為治療重癥肺炎提供新的策略。

辰英價(jià)值

在本研究中，長(zhǎng)光辰英P300共聚焦拉曼光譜儀憑借其高分辨率拉曼成像與高靈敏度光譜檢測(cè)能力，成功實(shí)現(xiàn)了肺炎克雷伯菌早期感染中宿主細(xì)胞代謝特征的原位解析。該儀器的非標(biāo)記、無損檢測(cè)特性使得樣本結(jié)構(gòu)得以完整保留，避免了傳統(tǒng)標(biāo)記方法的干擾。P300能夠在單細(xì)胞水平精準(zhǔn)識(shí)別脂質(zhì)與多糖的特征拉曼峰，并通過光譜熱圖直觀展示感染后宿主細(xì)胞的“脂質(zhì)堆積”現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)揭示“富脂”外泌體的致病機(jī)制提供了關(guān)鍵的代謝線索，充分體現(xiàn)了P300作為“代謝顯微鏡”在感染病理學(xué)研究中的重要應(yīng)用價(jià)值。其內(nèi)置的智能分析軟件支持深度數(shù)據(jù)挖掘，為解析病原體-宿主互作的早期代謝事件提供了強(qiáng)有力的工具支撐。

團(tuán)隊(duì)介紹

李亞男

吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒呼吸科教授、博士生導(dǎo)師，科室副主任。主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目及省部級(jí)科研項(xiàng)目；以第一完成人獲吉林省自然科學(xué)二等獎(jiǎng)。近年來以第一作者或通訊作者發(fā)表SCI論文20余篇，研究方向聚焦兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病。兼任中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科感染學(xué)組委員等多個(gè)學(xué)術(shù)職務(wù)。臨床思維靈活，擅長(zhǎng)疾病分析與診斷，新冠疫情期間組建吉林省首個(gè)兒童新冠病毒感染治療專區(qū)，獲央視新聞報(bào)道。

張影

吉林大學(xué)第一醫(yī)院副主任醫(yī)師。長(zhǎng)期從事感染性疾病的基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究，聚焦于病原體與宿主互作機(jī)制、感染微環(huán)境代謝重編程及新型抗感染策略開發(fā)。近年來，綜合運(yùn)用單細(xì)胞拉曼光譜、代謝組學(xué)與免疫學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，系統(tǒng)解析了多種病原菌早期感染的分子機(jī)制。相關(guān)研究成果發(fā)表于Clinical Science、Emerging Microbes & Infections 等國(guó)際期刊。主持多項(xiàng)國(guó)家級(jí)及省部級(jí)科研項(xiàng)目。

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