洗板（Wash Plate）是ELISA實(shí)驗(yàn)中操作次數(shù)最多的步驟，貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。洗板的目的是去除未結(jié)合的游離物質(zhì)，比如殘留在板孔中未能與固相抗原或抗體結(jié)合雜質(zhì)、酶標(biāo)記物等，以及實(shí)驗(yàn)過程中非特異性吸附與固相載體的干擾物質(zhì)，同時(shí)保留板上特異性結(jié)合的復(fù)合物。

「ELISA問診室」將為大家介紹ELISA實(shí)驗(yàn)中操作次數(shù)最多的步驟——洗版的注意事項(xiàng)。

一、洗滌液組分與配制

洗滌液組成比較簡單，一般由pH 7.4的PBS或TBS，加入0.05%-0.5%的Tween-20或Triton X-100組成。實(shí)驗(yàn)室常用PBS磷酸鹽緩沖體系，但如果使用堿性磷酸酶系統(tǒng)（如AP）則需改為TBS緩沖液。去污劑常選用Tween-20，其濃度在不同的實(shí)驗(yàn)室會(huì)存在差異，但不能高于0.2%，否則會(huì)使特異性結(jié)合物解離，進(jìn)而降低實(shí)驗(yàn)靈敏度。

商業(yè)化的ELISA試劑盒一般提供濃縮液，比如20X，可按照1:19的比例進(jìn)行稀釋，即取1mL濃縮液加入19mL去離子水稀釋混勻，具體稀釋量請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量配制，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。本次實(shí)驗(yàn)未使用完的1X洗滌液可以棄去。稀釋前應(yīng)先觀察恢復(fù)至室溫的濃縮液是否有結(jié)晶，如有還請(qǐng)混勻或在37℃水浴鍋中使其溶解。

二、傳統(tǒng)古法：純手工洗板

雖然現(xiàn)在已經(jīng)有樣式多樣的自動(dòng)或智能洗板機(jī)，但是作為傳統(tǒng)ELISA實(shí)驗(yàn)人，還是推崇手工洗板，可能是因?yàn)槭止ぜ?xì)胞靈活性更高吧。

手工洗板主要有以下步驟：

1）準(zhǔn)備工作

用去離子水或蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋到1X，將多層吸水紙鋪好，準(zhǔn)備洗板操作區(qū)域。如果是使用商業(yè)化試劑盒，還請(qǐng)使用配套的洗滌液，請(qǐng)勿使用其他的，防止影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2）加液

使用多道移液器或排槍，每孔中加入300-350μL 1X 洗滌液。加液時(shí)要保持槍口懸空，避免劃傷孔底或產(chǎn)生氣泡。洗滌液不要飛濺或溢出，防止污染。

3）浸泡

按照預(yù)實(shí)驗(yàn)或試劑盒說明書要求，靜置30秒至1分鐘，讓洗滌液與孔內(nèi)壁充分接觸，洗去未結(jié)合物。

4）倒液

體現(xiàn)技術(shù)活的時(shí)刻來了，操作要迅速、干脆，手腕不要左右搖擺，不能旋轉(zhuǎn)倒液。用拇指按住ELISA板一側(cè)的中間位置，用食指按照另一側(cè)，從底部托起ELISA板。然后迅速翻轉(zhuǎn)孔板，借助手臂的力量快速向下移動(dòng)并突然停止。連貫的動(dòng)作使液體借助慣性從孔板內(nèi)甩出。手指、孔板條和板托外側(cè)都不應(yīng)沾上液體，重復(fù)這個(gè)傾倒動(dòng)作一次。

5）拍板

均勻且有力的拍板3次，每次拍板可使孔板水平旋轉(zhuǎn)180度，確?？變?nèi)無可見液體。每次均將孔板倒扣在鋪有多層吸水紙的桌面上，每次拍板均要落在吸水紙未使用的區(qū)域。用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因?yàn)榧?xì)小的粉塵或碎屑會(huì)吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，復(fù)孔差值也較大。拍板需要巧勁并不是力量越大越好，力度太大可能會(huì)使抗體抗原結(jié)合物解離。

6）完成一輪洗板操作后重復(fù)以上第2-5步。一般洗板次數(shù)為3-5次。最后一次拍板后用干凈的濾紙擦拭孔板外部，清除殘留的洗滌液。不要讓孔板晾干，應(yīng)盡快加入底物，防止酶活性受到影響。

三、洗板機(jī)操作自動(dòng)化

與手工洗板相比，洗板機(jī)在效率、穩(wěn)定性、適應(yīng)性等方面優(yōu)勢(shì)較大。

首先將ELISA板置于洗板機(jī)上，并設(shè)置洗板程序：如加液量（每孔250-350μL）、浸泡時(shí)間（5-10分鐘）、清洗次數(shù)（3-5次）。

然后啟動(dòng)程序，洗板機(jī)會(huì)自動(dòng)完成加液、浸泡、倒液的全過程。

最后結(jié)束程序，取出ELISA板，并在干凈的吸水紙上用力拍干。

總之，ELISA洗板機(jī)通過自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的洗滌過程，有效提高實(shí)驗(yàn)的可靠性和效率，提升ELISA實(shí)驗(yàn)的成功率和準(zhǔn)確性。

四、ELISA洗板常見問題解決方案

Q1：ELISA在哪些操作步驟之后需要洗板呢？

在ELISA實(shí)驗(yàn)中，除了最后的顯色階段外，其他操作幾乎都需要洗板。比如：

1）包被之后：在抗原或抗體固定在孔板上，并完成孵育后需要進(jìn)行洗板。目的是除去未與板孔結(jié)合的蛋白，防止這些游離的蛋白干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2）封閉之后：用BSA、脫脂奶粉等封閉液完成封閉后，需要去除多余的封閉液。如果有封閉液殘留會(huì)競爭結(jié)合檢測抗體或樣本中的蛋白，導(dǎo)致假陰性或信號(hào)偏低。

3）酶標(biāo)板準(zhǔn)備：商品化的預(yù)包被的酶標(biāo)板在加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品之前，需要進(jìn)行洗板，確保板孔無雜質(zhì)并增強(qiáng)結(jié)合活性。

4）一抗孵育之后：待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、特異性一抗完成孵育后，需要洗板除去未結(jié)合的蛋白、雜質(zhì)等，這是降低背景噪聲關(guān)鍵的一步。

5）二抗孵育之后：酶標(biāo)二抗完成孵育后，進(jìn)行洗板操作。目的是除去未與一抗結(jié)合的酶標(biāo)二抗，降低背景信號(hào)。

總之，洗板作為ELISA實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟，幾乎貫穿整個(gè)操作過程，僅加入底物后顯示到加終止液兩步不需要洗板。

Q2：洗板次數(shù)不足會(huì)怎樣？

如果沒有完全除去未結(jié)合的蛋白或抗體，將會(huì)造成背景信號(hào)高、非特異性結(jié)合，導(dǎo)致整板全藍(lán)，出現(xiàn)假陽性。

Q3：過度洗板又會(huì)怎樣呢？

過度洗板會(huì)洗掉已經(jīng)結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物，導(dǎo)致整體顯色變?nèi)?、甚至“白板”?/p>

Q4：哪些操作會(huì)造成孔間交叉污染？

1）在用多通道移液器或排槍添加洗劑液時(shí)，槍頭伸到液面以下甚至戳到孔底。

2）洗滌液添加時(shí)飛濺或溢出到其他孔導(dǎo)致的污染。

3）在吸水紙的同一位置反復(fù)拍板。

Q5：不同試劑盒的洗滌液或者自己配的洗滌液可以混用嗎？

不可以。洗滌液的主要成分雖然大差不離，但是在具體濃度上可能會(huì)存在差異。混用可能會(huì)與實(shí)驗(yàn)體系不適配，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難預(yù)料。如果本試劑盒的洗滌液實(shí)在不夠用，建議咨詢產(chǎn)品的技術(shù)支持或查看說明書，充分了解洗滌液的組分及配比后再進(jìn)行替換。

Q6：洗滌液濃縮液出現(xiàn)顆粒物或沉淀，是變質(zhì)了嗎？

不一定。濃縮液鹽離子濃度相對(duì)較高，長期靜置或4℃保存，可能會(huì)有結(jié)晶析出。建議在使用前輕輕搖晃或37℃水浴至完全溶解。

實(shí)驗(yàn)室達(dá)人們，你們更信賴手工洗板還是洗板機(jī)呢？歡迎大家在評(píng)論區(qū)說出你的答案！

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