簡(jiǎn) 介

使用健康 AB 型野生斑馬魚、Tg (myl7: eGFP) 心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎進(jìn)行不同劑量的污染物暴露 (助溶劑 DMSO 的含量小于 0.2%)。待斑馬魚暴露至 72 hpf 后，轉(zhuǎn)移至黑色透明 96 孔板中。使用 MS-222 麻醉幼魚，將孔板以 200 rpm 離心 2 min，使斑馬魚側(cè)躺。

隨后使用 ImageXpress Micro Confocal 高內(nèi)涵成像系統(tǒng) (Molecular Devices) 在明場(chǎng)和 FITC 熒光場(chǎng)下進(jìn)行圖像采集 (圖 1)。設(shè)置成像程序參數(shù)如下：選擇 4X Plan Apo 物鏡，每孔拍攝視野數(shù)量 2×2，各個(gè)視野緊鄰；選擇激光自動(dòng)聚焦 (對(duì)焦到板底部，按底板厚度偏移) 和 Z 層垂直拍攝；針對(duì)熒光心臟圖像采集，選擇 FITC 通道，聚焦方式選擇 Laser with z-offset，選擇數(shù)字共聚焦，調(diào)整曝光時(shí)間和曝光強(qiáng)度，直到心臟圖像聚焦清晰，進(jìn)行拍攝。

特別指出的是，對(duì)于心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚，采集熒光圖像、視頻及平均熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。對(duì)心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行心臟跳動(dòng)視頻的制作，選擇 Stream Acquisition，拍攝幀數(shù)為 250 幀，選擇 Make movie 選項(xiàng)，選擇 100 幀圖片進(jìn)行 15s 視頻制作。

使用 Labelme 對(duì)所采集的圖像數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)注，獲取斑馬魚幼魚魚身、頭部、眼睛、心包、卵黃囊共計(jì) 5 個(gè)身體表型參數(shù)，以及心臟區(qū)域的心房和心室收縮和舒張時(shí)的組織輪廓、心室的長(zhǎng)軸和短軸共計(jì) 8 個(gè)參數(shù)。基于心跳平均熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算心率、RR 間期、QT 間期和 QTc 間期指標(biāo)。其他心臟功能評(píng)估指標(biāo) (心室舒張末期體積 (EDV)、心室收縮末期體積 (ESV)、心室舒張末期面積 (EDA)、心室收縮末期面積 (ESA)、每搏輸出量 (SV)、心室短軸收縮率 (FS)、射血分?jǐn)?shù) (EF)、面積變化分?jǐn)?shù) (FAC)、心輸出量 (CO)) 則基于心率及心室的長(zhǎng)軸、短軸和面積計(jì)算而得。

基于拍攝的圖像，使用 ImgAug 開發(fā)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)增強(qiáng)，最終獲得 3650 張圖像用于構(gòu)建識(shí)別斑馬魚體長(zhǎng)的模型，獲取 3465 張圖像用于構(gòu)建識(shí)別斑馬魚頭部、眼睛、心包、卵黃囊區(qū)域的模型，獲取 3051 張圖像用于構(gòu)建識(shí)別斑馬魚心房及心室區(qū)域的模型。將增強(qiáng)后的圖像數(shù)據(jù)集進(jìn)行劃分，其中 80% 作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)，10% 作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)，10% 作為測(cè)試數(shù)據(jù)。通過(guò) YOLOv8 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合 OpenCV 形態(tài)學(xué)操作等方法，開展斑馬魚幼魚的體表和心臟形態(tài)的分析，通過(guò)識(shí)別并檢測(cè)各個(gè)部位的形貌特點(diǎn)，提取表型特征 (5 個(gè)身體表型，8 個(gè)心臟表型參數(shù))。其他心功能參數(shù)則基于心臟表型參數(shù)計(jì)算獲得。最終，構(gòu)建在明場(chǎng)下對(duì)斑馬魚體表形態(tài)識(shí)別的模型和在熒光場(chǎng)下對(duì)斑馬魚心臟形態(tài)識(shí)別及功能評(píng)估的模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)斑馬魚圖像的批量處理測(cè)量和評(píng)估?；跇?gòu)建的方法，可開展各類化學(xué)品對(duì)斑馬魚的發(fā)育毒性和心臟毒性的高通量篩查。

圖 1 化學(xué)品暴露、圖像采集及表型分析的流程。

構(gòu)建的模型可基于一張明場(chǎng)下斑馬魚圖像，識(shí)別、檢測(cè)、定量輸出魚的頭部、眼睛、心包以及卵黃囊的面積及魚身長(zhǎng)度 (圖 2)。從表 1 可以看出，構(gòu)建的模型對(duì) 5 個(gè)部位識(shí)別的性能指標(biāo)如下：精度均大于 0.935，召回率均大于 0.960，F(xiàn)1 Score 和 mAP50 均大于 0.950，表明模型具有優(yōu)異的分割和識(shí)別效果^[4]。

圖 2 表型特征 (體長(zhǎng)、卵黃囊、頭部、眼睛、心包) 的預(yù)測(cè)結(jié)果。

表 1 斑馬魚身體表型參數(shù)的模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。

基于斑馬魚熒光心臟視頻可構(gòu)建心臟表型模型，用于識(shí)別、檢測(cè)、定量輸出心房和心室收縮和舒張的面積和長(zhǎng)度 (圖 3)。模型對(duì)舒張和收縮時(shí)心房和心室部位的識(shí)別精度均大于 0.970，召回率大于 0.940，F(xiàn)1 Score 和 mAP50 均大于 0.960，表明構(gòu)建的模型對(duì)心臟表型具有良好的分割和識(shí)別效果 (表 2) ^[5]?；讷@取的平均心臟熒光數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出心率，RR 間期、QT 間期和 QTc 間期指標(biāo)?；谝陨蠀?shù)，可進(jìn)一步計(jì)算獲得以下心臟功能參數(shù)，包括 EDV、ESV、EDA、ESA、SV、FS、EF、FAC、CO。

圖 3 心臟特征 (收縮和舒張時(shí)心室和心房的面積) 模型的預(yù)測(cè)結(jié)果。

表 2 斑馬魚心臟表型參數(shù)的模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。

該研究構(gòu)建了一種基于斑馬魚的集化學(xué)品毒性高通量測(cè)試、圖像采集、身體表型及心臟表型識(shí)別及定量分析為一體的方法?；谠摲椒ǎ到y(tǒng)研究了 15 種新污染物對(duì)斑馬魚的毒性。該方法具有識(shí)別速度快、準(zhǔn)確率高、涵蓋評(píng)價(jià)指標(biāo)多等優(yōu)勢(shì)，能夠提高化學(xué)品發(fā)育和心臟毒性評(píng)價(jià)的效率和準(zhǔn)確度，可用于化學(xué)品的早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和健康預(yù)警。