前言

近年來，重組質(zhì)粒DNA (pDNA) 被越來越多地用作基因ZL原料藥 (例如: 用于生產(chǎn)慢病毒和AAV載體) 以及DNA疫苗的活性成分。藥物級質(zhì)粒DNA必須要符合宿主相關(guān)雜質(zhì)、均一性方面的要求 (例如: pDNA拓撲異構(gòu)體的含量: 共價閉環(huán)的超螺旋 (CCC)、開環(huán) (OC) 和線型 (L) 以及二聚體或多聚體)。在大規(guī)模質(zhì)粒發(fā)酵過程中，質(zhì)粒主要以超螺旋形式存在。進入到下游工藝時，一些質(zhì)?？赡軙霈F(xiàn)缺口，轉(zhuǎn)化為開環(huán)和線型的形式。

在本篇推送中，我們將介紹一種使用陰離子交換色譜柱TSKgel DNA-NPR對pDNA樣品進行快速、準確表征的HPLC分析法1)。并且，該方法可以非常容易地從HPLC轉(zhuǎn)移到UHPLC系統(tǒng)。

1. 實驗條件

實驗中以pBR322 (DY種廣泛使用的大腸桿菌克隆載體) 為例。質(zhì)粒pBR322的長度為4361個堿基對，分子量為2.83×10⁶Da。為了正確分類拓撲異構(gòu)體，我們用限制性單切酶EcoRI來孵育制備線型質(zhì)粒。pBR322在位置4359處具有一個EcoR1限制性酶切位點。消化時，每μg DNA使用1單位的限制性內(nèi)切酶。講樣品在37℃下孵育60分鐘后，通過將溫度提升至65℃并加熱20分鐘來終止反應(yīng)。

2. 快速分離質(zhì)粒拓撲異構(gòu)體

圖1是使用TSKgel DNA-NPR分析pBR322的色譜圖。在5分鐘的線性梯度下以1.0 mL/min流速分析質(zhì)粒。3個洗脫峰代表了質(zhì)粒的三種不同類型：超螺旋、開環(huán)和線型。其中，ZG峰對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒。

圖1. pBR322的AEX分離譜圖

線型質(zhì)粒的分析條件與超螺旋質(zhì)粒相同。圖2的單峰色譜圖表示的是EcoR1消化后的線型質(zhì)粒。圖3是兩個色譜圖的疊加圖?？梢宰C實峰3對應(yīng)了線型質(zhì)粒。

圖2. EcoR1消化后的線型pBR322的分離譜圖

圖3. 疊加圖

3. 總結(jié)

TSKgel DNA-NPR離子交換色譜柱由2.5μm的親水性無孔聚合物顆粒充填，顆粒表面采用弱陰離子交換基團修飾。無孔顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)快速傳質(zhì)，這是實現(xiàn)高分辨率分離的關(guān)鍵因素。

使用TSKgel DNA-NPR能夠簡便、快速地區(qū)分出超螺旋、開環(huán)和線型三種不同形式的質(zhì)粒DNA。該分析方法非常適用于藥物級pDNA研發(fā)和生產(chǎn)的各個階段，而且還可同時用于HPLC和UHPLC系統(tǒng)。

4. 參考文獻

1.Characterization of Plasmid DNA Samples by Chromatographic Methods; Hermann Schuchnigg,Patricia Cantarell,Christoph Pollak,Jochen Urthaler,Wolfgang Buchinger;Boehringer Ingelheim Austria GmbH, Poster HPLC 2008,Baltimore,MD,USA