蛋白純化中Z常用的一種方就是色譜法（chromatography），這種方法除了能夠?qū)⒋罅康募兓鞍踪|(zhì)制備出來，還能夠使蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性得以保持。有多種多樣的色譜，包括GX液相色譜以及常規(guī)色譜，離子交換GX液相色譜（ion exchange HPLC）以及反相GX液相色譜（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）均屬于GX液相色譜，而常規(guī)色譜分別為親和色譜、離子交換色譜以及凝膠過濾色譜。純化蛋白質(zhì)可以按照目標(biāo)蛋白性質(zhì)的不同對色譜分離技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的選用。

1.親和色譜法

與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特征為許多生物大分子所具備，例如生物素與親合素、核酸片段與其互補(bǔ)的核酸序列、激素與受體、抗原與抗體、輔助因子、酶與YZ劑以及酶與底物等。這種分子之間的結(jié)合稱為親和力。

利用生物大分子間所具有的特異性親和能力進(jìn)行分離的方法叫做親和色譜（affinity chromatography）。這種方法一般在不溶于水的化合物上固定可親和的一對分子中的一方，作為色譜的支持體即載體，使之固相化，作為固定相；另一方隨流動相流經(jīng)固定相，雙方就能夠發(fā)生特異性結(jié)合。經(jīng)過一段時間的洗滌流動相，就能夠去除雜質(zhì)，之后再對親和吸附的可逆特性進(jìn)行利用，改用特殊的流動相解離下所需分離的物質(zhì)，從而使得純化的物質(zhì)獲得。

親和色譜法中有很多種類的載體，瓊脂糖凝膠（sepharose）Z為常用，有較多的羥基在其分子上，活化后能夠耦聯(lián)親和分子相，除此以外，其有著穩(wěn)定的理化性質(zhì)，不會對色譜的分離過程產(chǎn)生影響。能夠在溫和條件下操作親和色譜法，純化過程分辨率高，快速，簡單，對于性質(zhì)不穩(wěn)定并且分離含量極少的生物活性物質(zhì)非常的有效。然而由于特異的親和力不是任何生物大分子之間均具有，所以需要制備專一的親和色譜柱針對于某一種親和分子。所以親和色譜的應(yīng)用具有一定的局限性，主要在酶、抗原、抗體的分離與純化時使用。

2.凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法（gel-filtration chromatography, GFC）又叫做排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀顆粒物質(zhì)，例如葡聚糖凝膠（sephadex）和瓊脂糖凝膠（sepharose）。在色譜柱中裝入凝膠顆粒就能夠用來分離物質(zhì)。當(dāng)從凝膠柱通過被分離物質(zhì)時，凝膠內(nèi)部，大于凝膠孔徑的分子進(jìn)入不了，只能夠流動和分配于凝膠顆粒之間的空隙中，只流經(jīng)很短的路途，能夠白很快的洗脫出來。而小于凝膠孔徑的分子則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，穿行在凝膠內(nèi)部，有著很慢的移動的速度，流經(jīng)的路程長，Z后洗脫出來。純化的物質(zhì)的獲得是通過對不同時相的洗脫液的分別收集。

3.離子交換色譜法

按照物質(zhì)的分子大小、極性、酸堿度的不同進(jìn)行分離的技術(shù)，叫做離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC），一般吸附、吸收、擴(kuò)散、穿透、靜電引力等復(fù)雜的物理化學(xué)過程包含其中。

自然界中生物大分子均帶有電荷，也包括蛋白質(zhì)。當(dāng)從離子交換色譜柱通過所需分離的物質(zhì)時，因為分子量、所帶電荷等不同，固定相利用靜電引力吸附了一些物質(zhì)，緩沖液首先洗脫出了未被吸附的物質(zhì)。被吸附的物質(zhì)因為所帶電荷多少不同，有著大小不同的親和力，梯度離子緩沖液會先后洗脫出它們。分離出同一溶液中的不同物質(zhì)。色譜柱中，使用填充的陽離子交換劑來分離帶負(fù)電荷物質(zhì)，使用填充的陰離子交換劑分離帶正電荷物質(zhì)。