眾所周知，吸煙和二手煙對(duì)身體傷害極大！危害包括增加肺癌的發(fā)病率、導(dǎo)致不孕或胎兒畸形、容易骨質(zhì)疏松等。

2020年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，對(duì)北京、上海、深圳等六城市的餐飲場(chǎng)所工作人員進(jìn)行了大規(guī)模的研究調(diào)查，經(jīng)檢測(cè)即使是已出臺(tái)全面無(wú)煙立法城市，可替寧檢出率34.12%，三羥基可替寧檢出率16.32%；未出臺(tái)全面無(wú)煙立法城市，相應(yīng)指標(biāo)更高，可替寧檢出率68.04%，三羥基可替寧檢出率41.94%。

（數(shù)據(jù)來(lái)源：中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，年,卷(期)：2021,55(12)）

如此高的檢出率！煙草煙霧暴露，成為一個(gè)不容忽視的重要社會(huì)問(wèn)題。

尼古丁是煙草中含量Z高的生物堿，在人體內(nèi)半衰期較短，其70%～80%代謝產(chǎn)物為可替寧。當(dāng)接觸煙草煙霧后，在人體的不同生物樣本基質(zhì)中均可檢測(cè)出可替寧。可替寧在人體中可進(jìn)一步代謝為3-羥基可替寧，因此，可替寧和3-羥基可替寧可作為煙草煙霧暴露的生物標(biāo)志物。

為了您和家人身體健康，遠(yuǎn)離吸煙和二手煙。

血漿中可可替寧和 3-羥基可替寧的測(cè)定

納鷗科技助力尼古丁代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的檢測(cè)，本應(yīng)用在檢測(cè)血漿中可替寧和羥基可替寧的基礎(chǔ)上，對(duì)樣本前處理流程、液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了檢測(cè)血漿中可替寧和羥基可替寧的檢測(cè)方法。

一、摘要:

目的  建立血漿中可替寧和 3-羥基可替寧的固體介質(zhì)液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定法。

方法  在血漿樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)和氫氧化鉀后,使用 96孔SLE液液萃取板凈化,凈化液經(jīng)異丙醇二氯甲烷溶液洗脫、氮?dú)獯蹈?純水復(fù)溶,使用Anavo XP C18色譜柱(100 mmⅹ2.1 mm,1.7 μm)，以 0.1%氨水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù)。

結(jié)果  可替寧和羥基可替寧在0.1~300 ng/ml線性范圍內(nèi)方法線性良好（r＞0.999）,可替寧方法定量下限為0.03 ng/ml,三羥基可替寧方法定量下限為0.02 ng/ml?？商鎸幍募訕?biāo)回收率為95.0%~99.4%,RSD為2.1%~3.3%。三羥基可替寧的加標(biāo)回收率為95.8%~97.4%，RSD為2.1%~4.2%。結(jié)論  該方法取樣量少、操作簡(jiǎn)便、方法精密度高,適合大規(guī)模樣品的篩查檢測(cè)工作。

二、測(cè)定原理

可替寧、3-羥基可替寧通過(guò)同位素稀釋高效液相色譜質(zhì)譜方法測(cè)量。向血漿（清）樣品中加入甲基-D3-可替寧、反式3-羥基可替寧-D3作為內(nèi)標(biāo)，樣品堿化然后加入到液體提取盤(pán)（SLE)）中。分析物被混合的異丙醇和二氯甲烷提取，濃縮，剩余物復(fù)溶后進(jìn)樣到C18色譜柱上，洗脫液洗脫，LC-MS測(cè)定。

可替寧的母離子為m/z 177，子離子為m/z 80，3-羥基可替寧的母離子為m/z 193，子離子為m/z 80。內(nèi)標(biāo)和離子對(duì)配合各自的監(jiān)控化合物。以標(biāo)準(zhǔn)系列峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比和可替寧、3-羥基可替寧濃度，做工作曲線。

三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

Anavo 96孔板正壓固相萃取裝置（PN：AN25D021）

Anavo 96孔板氮吹儀（PN:AN25D020）

Anavo SLE+ 400mg 96孔板(PN: AN25H007)

Anavo 2m深孔96孔板收集盤(pán)（PN: AN25J017）

Anavo XP雜化硅膠UHPLC C18色譜柱（PN：AN80A006）

12通道300μL移液器

漩渦振蕩器

冰醋酸、醋酸銨、氫氧化鉀：優(yōu)級(jí)純

異丙醇、甲醇、二氯甲烷：色譜純

2、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

可替寧：100μg/mL、 3-羥基可替寧：100μg/mL， 甲基-D3-可替寧: 100μg/mL、反式3-羥基可替寧-D3: 100μg/mL
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制    

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的COT和HC標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于純水，得到0.10、0.30、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00、30.00、50.00、100.00、300.00 ng/ml的COT和HC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，含D3-COT和D3-HC內(nèi)標(biāo)濃度為20.0 ng/ml。以COT、HC定量離子峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積之比對(duì)COT、HC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、樣品前處理

準(zhǔn)確吸取 200 μl樣本（高濃度樣本吸取50 μl血漿+純水150 μl），依次加入50 μL的0.2 mol/L 氫氧化鉀溶液、50 μl的D3-COT 和 D3- HC 混合內(nèi)標(biāo)溶液到 96 孔混合盤(pán)中，使用排槍抽吸混勻。將上述混合溶液全部轉(zhuǎn)移至SLE提取盤(pán)中，放置5 min。加入0.3 ml 的5%異丙醇二氯甲烷混合液，放置5 min后，使用96孔正壓固相萃取裝置以3.5 psi氮?dú)鈮?0 s（該流程重復(fù)6次）。合并洗脫液于96孔板收集盤(pán)中，放置于96孔氮吹儀上用氮?dú)獯蹈桑蹈珊蠹尤?00 μl純水復(fù)溶，蓋上密封墊，漩渦混勻后上機(jī)檢測(cè)。

5、LC-MS-MS測(cè)定

1）HPLC的條件和參數(shù)分析柱：Anavo XP C18, 1.7μm, 2.1*100mm（PN：AN80A006)流動(dòng)相：0.1%氨水-乙腈梯度洗脫條件：見(jiàn)表1。進(jìn)樣量：5 μl流速：300 μl/min柱溫：40 ℃表1 梯度洗脫條件（體積分?jǐn)?shù)）

2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描，噴霧電壓：4500 V；離子源溫度：550 ℃，碰撞氣壓力：中性碰撞氣；氣簾氣壓力：0.24 MPa；霧化氣壓力（GS1）和輔助加熱器壓力（GS2）：0.38 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表2 質(zhì)譜條件

可替寧色譜圖

3-羥基可替寧色譜圖

配套關(guān)鍵耗材

特色產(chǎn)品推薦：BioSin 96孔板氮吹儀