介紹
生物研究和藥物發(fā)現(xiàn)越來越需要擴(kuò)大基于細(xì)胞的檢測方法的多樣性和復(fù)雜性?；罴?xì)胞檢測可以實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞反應(yīng)，并提供關(guān)于化合物治療效果和生物復(fù)雜性的重要見解。我們使用 ImageXpress Pico 自動細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時定量細(xì)胞成像分析，以監(jiān)測細(xì)胞模型中anticancer化合物的復(fù)雜效果。
為了描述anticancer化合物的作用，我們監(jiān)測了HeLa 宮頸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的時間依賴效應(yīng)。環(huán)境控制 (EC) 室用于提供所需的CO2 和 O2 濃度。采用透射光延時成像技術(shù)對細(xì)胞數(shù)量、融合度、細(xì)胞面積進(jìn)行量化，采用熒光標(biāo)記技術(shù)評價化合物處理對細(xì)胞周期的影響。
使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)結(jié)合 CellReporterXpress 成像采集和分析軟件進(jìn)行細(xì)胞檢測。該成像設(shè)備提供五個熒光通道加上透射光 (brightfield) 以及比色成像。環(huán)境控制室和高精度自動移動臺支持長時間、延時顯微成像技術(shù)，可自動監(jiān)測細(xì)胞增殖、分化、化合物毒性和各種其他基于細(xì)胞的檢測。

方法
環(huán)境控制和延時監(jiān)測

ImageXpress Pico 系統(tǒng)配備了一個環(huán)境控制室，可以控制和監(jiān)控溫度、CO2 和 O2 濃度以及濕度。與延時成像相結(jié)合，它提供了一個有效的工具進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)，包括缺氧條件。
細(xì)胞培養(yǎng)
HeLa 細(xì)胞 ( 取自 ATCC ) 以每孔 3000 個細(xì)胞的密度培養(yǎng)在 384 孔黑色透明底微孔板 (Corning, #3663)，在 37℃ 和 4% CO2的環(huán)境控制室中培養(yǎng) 24 小時?；衔锾幚?4 小時，如圖 1-4 所示。穩(wěn)定表達(dá)組蛋白mCherry-H2B 和 Tubulin-GFP 的 HeLa細(xì)胞由 Málnási-Csizmadia 博士提供，并與正常 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行類似的培養(yǎng)和處理。

優(yōu)勢
? 通過環(huán)境控制和延時成像進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
? 實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞分裂及化合物效應(yīng)評估
? 輕松導(dǎo)出延時數(shù)據(jù)到 MP4 格式，并保存為視頻

圖 1 利用透射光照明，用 10X 物鏡拍攝 HeLa 細(xì)胞的圖像。 細(xì)胞計數(shù)的分析掩模顯示為白色疊加( 占整個圖像的 20% )。重要的是由于分析 protocol 無法修改或調(diào)整，因此在圖像采集過程中需要對 protocol 進(jìn)行優(yōu)化。通常曝光時間在 1-6 毫秒范圍內(nèi)，而對焦偏移量通常為 -8。

細(xì)胞成像
為了使細(xì)胞成像結(jié)果可視化，并監(jiān)測細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡，在 24 小時內(nèi)，每隔 1 至2 小時用透射光 10X 物鏡獲取圖像。在圖像采集過程中使用透射光細(xì)胞計數(shù)通用分析 protoco (Transmitted light cell countgeneral analysis) 進(jìn)行圖像分析。分析提供了細(xì)胞數(shù)量、平均細(xì)胞面積和總細(xì)胞覆蓋面積的測量。
結(jié)果
利用透射光細(xì)胞計數(shù)評估化合物對細(xì)胞活力和增殖的影響
通過獲取延時圖像，監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)的表型變化。用透射光或熒光標(biāo)記物在 EC 室中對細(xì)胞進(jìn)行 24 小時以上的監(jiān)測。將細(xì)胞分別鋪到 96 孔或 384 孔板中，每孔分別為12,000 細(xì)胞或 3,000 細(xì)胞。使用 10X 物鏡，每隔一至兩小時采集一次透射光圖像，連續(xù) 24 小時，96 孔板中每孔成像 4個位點(diǎn)， 384 孔板中每孔成像 1 個位點(diǎn)。在圖像采集過程中進(jìn)行自動圖像分析。圖像分析包括在透射光下尋找細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)量、單個細(xì)胞面積、細(xì)胞覆蓋面積 ( 圖1 )。根據(jù)大小和形狀識別死亡細(xì)胞，以區(qū)分出健康細(xì)胞的分析。用繪圖工具觀察細(xì)胞增殖的動力學(xué)曲線。圖 2 顯示了 96 孔板中每孔細(xì)胞數(shù)隨時間的增加，以此作為增殖的指示。
利用透射光成像和分析方法對anticancer化合物的作用時間進(jìn)行了評價。通過連續(xù) 24 小時每兩小時采集一次活細(xì)胞圖像，觀察化合物效應(yīng)對細(xì)胞增殖的影響。觀察星孢菌素和絲裂霉素 C 對細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性 ( 圖 3 )。為了表征化合物效應(yīng)，利用 SoftMaxPro 軟件中的 4 參數(shù)曲線擬合算法計算出抑制細(xì)胞增殖 ( 細(xì)胞數(shù)量減少 ) 的化合物 EC50 值 ( 圖 3B )。

圖 2 在 24 小時內(nèi)實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞增殖和化合物效應(yīng)。 細(xì)胞培養(yǎng)在 96 孔或 384 孔板中，并放置在 EC室。利用 10X 物鏡，每 1-2 小時采集透射光圖像，96 孔板每孔 4 個視野，384 孔板每孔 1 個視野。在采集過程中進(jìn)行自動圖像分析。注意當(dāng)使用 IX-Pico 環(huán)境控制室時沒有邊緣效應(yīng)

圖 3 細(xì)胞增殖和細(xì)胞數(shù)量濃度依賴性變化的時間進(jìn)程。(A) 時間進(jìn)程數(shù)據(jù)可視化顯示了對照孔和用增加的指示化合物濃度 ( 重復(fù)孔 ) 處理的孔的細(xì)胞計數(shù)。 (B) 24 小時濃度依賴性檢測結(jié)果：絲裂霉素C (紅色；IC50 0.27 μM), 以及 星孢菌素 ( 綠色；IC50 0.05 μM )
利用熒光標(biāo)記實(shí)時識別有絲分裂細(xì)胞
我們監(jiān)測了穩(wěn)定表達(dá)組蛋白 mCherry?H2B和 Tubulin-GFP 的 HeLa 細(xì)胞的分裂。通過使用熒光標(biāo)記的組蛋白和細(xì)胞骨架蛋白，可以跟蹤單個細(xì)胞在細(xì)胞周期中的進(jìn)展。圖4顯示了 5 個細(xì)胞，每個細(xì)胞在 12小時內(nèi)分裂。細(xì)胞間橋和形成的紡錘體是可見的 ( 白色箭頭 )。核小而明亮的有絲分裂細(xì)胞可以通過圖像分析來識別。計數(shù)所有細(xì)胞核 ( H2B-mCherry ) 和 GFP 染色面積 (tubulin) 也可以監(jiān)測細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞擴(kuò)散 ( 圖 4B )。

圖 4 有絲分裂細(xì)胞的活細(xì)胞檢測。 圖像系列顯示 HeLa 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) mCherry-H2B, Tubulin-GFP，正在進(jìn)行細(xì)胞分裂。用箭頭表示有絲分裂細(xì)胞，在 10X 物鏡、FITC 和 TRITC 光照下，每 2 小時采集一次圖像，持續(xù) 25 小時。通過計算有絲分裂細(xì)胞總數(shù)與有絲分裂細(xì)胞數(shù)的比值，可以計算出有絲分裂細(xì)胞的百分比(%)
結(jié)論
總的來說，我們的研究結(jié)果證明了環(huán)境控制室和活細(xì)胞延時成像技術(shù)可以用于實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞分裂和評估化合物效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，On the fly 即時分析的圖像分析提供了細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞表型變化的自動監(jiān)測。Z后延時數(shù)據(jù)可以很容易地導(dǎo)出為MP4 格式，并保存為視頻。