作為苯二氮卓類藥物的代表藥物，地 西泮(DZP)起到鎮(zhèn)靜安眠的作用，在臨床上廣泛用于焦慮癥和抑郁癥的治 療。然而，DZP也常被非法作為動(dòng)物抗應(yīng)激藥物使用，甚至非法添加到鎮(zhèn)靜保健品中，嚴(yán)重威脅動(dòng)物源性食品衛(wèi)生安全和人類健康。大量使用的DZP通過(guò)各種途徑排放進(jìn)入環(huán)境中導(dǎo)致水體環(huán)境污染普遍存在。文獻(xiàn)報(bào)道水體環(huán)境中存在地 西泮的5種氯化消毒副產(chǎn)物，因此需要深入探討DZP氯消毒副產(chǎn)物的分布和毒性調(diào)控機(jī)制，為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和人群健康提供依據(jù)。

北京市疾控預(yù)防控制中心邵兵研究員團(tuán)隊(duì)和中國(guó)農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)院合作在《Talanta》發(fā)表了《Distribution visualization of the chlorinated disinfection byproduct of diazepam in zebrafish with desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging》，又在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上發(fā)表了題為《Chlorine disinfection byproduct of diazepam affects nervous system function and possesses gender-related difference in zebrafish》的研究論文。兩篇文章通過(guò)解析電噴霧電離質(zhì)譜成像，直觀高效地分析了地 西泮氯化消毒副產(chǎn)物中的2-甲胺基-5-氯二苯甲酮(MACB)在斑馬魚體內(nèi)的分布及其代謝產(chǎn)物，同時(shí)利用主成份分析和偏Z小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，探討了MACB對(duì)斑馬魚的神經(jīng)毒性影響和性別差異。

實(shí)驗(yàn)方法

01 樣品制備

4月齡的斑馬魚暴露于濃度為1 μg/L MACB中，分別于暴露后24h、48h、72h、96h利用麻醉劑安樂(lè)死，然后包埋于盛有5%羧甲基纖維素的錫紙盒中，立刻保存于-80 ℃冰箱。利用冷凍切片機(jī)將斑馬魚切成厚度為50 μm貼于載破片上，進(jìn)行DESI-MSI分析。

02 DESI實(shí)驗(yàn)條件

采用配備有DESI源的Waters Xevo G2-XS QTof 質(zhì)譜儀進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。 

• DESI參數(shù)：霧化氣體（氮?dú)猓?/p>

• 壓力：0.45 MPa

• 噴霧溶劑：80% MeOH、20% H2O（含0.1%甲酸和0.1 mM亮氨酸腦啡肽），流速為3 μL/min

• 毛細(xì)管電壓：4.5 kV

• 電離方式：正離子模式，掃描質(zhì)量范圍m/z 100 - 1,000，像素大小為200 μm，掃描速率400 μm/s 。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01 DESI定量的探討

分別將5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、125 μg/mL、500 μg/mlL取1 μL輕輕點(diǎn)在沒(méi)有MACB暴露下斑馬魚切片的背側(cè)區(qū)，置于室溫晾干，用DESI-QTOF分析。

圖1. MACB在斑馬魚脊背側(cè)區(qū)部分建立額標(biāo)準(zhǔn)曲線。

02 利用DESI獲得MACB在斑馬魚體內(nèi)的分布

DESI-MS成像結(jié)果顯示，MACB通過(guò)血腦屏障進(jìn)入斑馬魚的腦部位。雌性斑馬魚暴露MACB 24h后，MACB分布于斑馬魚全身，隨著時(shí)間推移，MACB在斑馬魚體內(nèi)的含量逐漸降低，但是在雄性體內(nèi)MACB的分布趨勢(shì)與雌性斑馬魚相反，存在明顯性別差異。

圖2. 不同時(shí)間點(diǎn)暴露下MACB在雌性、雄性斑馬魚體內(nèi)分布。

另外，MACB可在斑馬魚不同組織中積累，根據(jù)前面建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（范圍是5 μg/mL - 500 μg/mL）,斑馬魚體內(nèi)的MACB濃度在5.22 - 174.22 μg/mL，DESI質(zhì)譜成像可用于測(cè)定MACB在斑馬魚體內(nèi)的分布和半定量，以上結(jié)果表明利用DESI-MS成像技術(shù)可以很好地探索目標(biāo)化合物在生物體內(nèi)的分布。

03 利用DESI-MS獲得MACB在斑馬魚體內(nèi)的代謝物

同時(shí)通過(guò)DESI-MS成像分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比m/z 230.0818的物質(zhì)在斑馬魚體內(nèi)的時(shí)空分布趨勢(shì)與母體化合物MACB一致，這表明m/z 230.0818是MACB的代謝物質(zhì)。MACB的代謝物在雌性斑馬魚分布趨勢(shì)與雄性斑馬魚相反，也存在明顯的性別差異。

圖3. MACB的代謝物m/z 230.0833在斑馬魚體內(nèi)的分布。

04 利用DESI-MSMS對(duì)MACB的代謝物m/z 230.0833進(jìn)行定性分析

DESI是一種相對(duì)無(wú)損的分析技術(shù)，在同一個(gè)切片上先進(jìn)行DESI-MS分析，再進(jìn)行DESI-MSMS分析。文章分別對(duì)MACB和m/z 230.0833進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜圖成像分析，根據(jù)母離子和子離子的精確質(zhì)量數(shù)，可以推斷代謝物m/z 230.0833的結(jié)構(gòu)為MACB脫甲基成環(huán)。

圖4. MACB 在斑馬魚切片上的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5 . MACB的代謝物在斑馬魚切片上的二級(jí)質(zhì)譜圖。

05 利用DESI進(jìn)行空間組學(xué)分析來(lái)解釋MACB的神經(jīng)毒性和性別差異

為探討MACB對(duì)斑馬魚體的神經(jīng)毒性和性別差異，將斑馬魚脊髓的物質(zhì)進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)MACB暴露后體內(nèi)物質(zhì)具有組間差異。同時(shí)通過(guò)OPLS-DA對(duì)72h和空白對(duì)照組進(jìn)行分析，m/z 104.1079、m/z 118.0870、m/z 132.0778等內(nèi)源性物質(zhì)具有顯著性差異，分別是膽堿、纈氨酸、肌酸。同時(shí)為了驗(yàn)證MACB是否干擾體內(nèi)氨基酸的穩(wěn)態(tài)，又用了傳統(tǒng)的高效液相色譜法檢測(cè)斑馬魚體內(nèi)的氨基酸含量。

圖6. MACB暴露0h、24h、48h、72h斑馬魚脊髓部位的PCA圖。

圖7. MACB暴露0h、72h斑馬魚脊髓部位的S-Plot圖。

小結(jié)

DESI-MSI在環(huán)境暴露組學(xué)和環(huán)境毒理的應(yīng)用證明了其強(qiáng)大的功能和實(shí)用性。本研究通用DESI-MSI技術(shù)探究了地 西泮的消毒副產(chǎn)物MACB在斑馬魚體內(nèi)的分布和代謝。利用DESI-MSI得到MACB及其代謝物在斑馬魚的分布，并且通過(guò)DESI-MSMS對(duì)新的代謝物進(jìn)行定性分析。通過(guò)DESI-MSI進(jìn)行空間組學(xué)分析，對(duì)MACB對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響和性別差異進(jìn)行深度分析。