2025 年 5 月 14 日，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫偉團隊、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所賈美榮團隊與成都中醫(yī)藥大學(xué)本草基因組學(xué)研究院陳士林院士團隊在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition，影響因子 16.6）在線發(fā)表題為“Completing the Biosynthesis of the Clinically Important Diterpenoid Andrographolide in Andrographis paniculata”的研究論文。該研究通過多組學(xué)聯(lián)合分析（基因組-轉(zhuǎn)錄組-代謝組），結(jié)合本氏煙草（Nicotiana benthamiana）瞬時表達系統(tǒng)及酵母微粒體體外催化實驗，成功從穿心蓮中鑒定出 4 個參與生物合成的細胞色素 P450 酶（CYP450s），首次完整解析了穿心蓮內(nèi)酯的生物合成途徑，并實現(xiàn)該藥物在煙草體系中的異源合成。

研究背景

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide）是從爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata）中提取的 ent- 半日花烷型二萜類單體化合物，具有顯著的抗炎活性，其工業(yè)化生產(chǎn)目前仍完全依賴植物提取。雖然穿心蓮內(nèi)酯的二萜骨架 ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）已實現(xiàn)生物合成，但其后續(xù)的氧化修飾機制長期未被闡明。

研究結(jié)果

團隊前期研究表明，穿心蓮內(nèi)酯的生物合成受到茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導(dǎo)。茉莉酸甲酯處理條件下，骨架合成基因 ApCPS2 表達模式和穿心蓮內(nèi)酯積累模式一致。通過將茉莉酸甲酯處理后基因組注釋的 CYP450s 基因和 ApCPS2 進行相關(guān)性分析，在 r>0.85 閾值下篩選到 20 個與 ApCPS2 表達高度相關(guān)的 CYP450 候選基因（圖 1）。

圖 1. A 穿心蓮植物照片 B.MeJA 處理后穿心蓮幼苗中代謝物分析。C. 生物合成途徑示意圖。D. 穿心蓮注釋 CYP450s 和 ApCPS2 表達水平之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)（r>0.85）。

將候選 CYP450s 逐一與 ent-copalol 合成基因（AstHMGR，AgGGPPS 和 ZmCPS2）在煙草中進行瞬時表達發(fā)現(xiàn)，僅有 ApCYP71D587 和 ApCYP71BE50 可催化 ent-copalol 產(chǎn)生新化合物。通過分離純化確認 ApCYP71D587 催化 ent-copalol 形成 19-hydroxy-ent-copalol；ApCYP71BE50 催化 ent-copalol 生成了主產(chǎn)物 ent-15，16-epoxy-labda-8（17），13（14）-diene、ent-15，16-epoxy-labda-8（17），13（16），14-triene 以及副產(chǎn)物 19-dehydroxy-andrograpanin（圖 3）；考慮到 ApCYP71BE50 能夠催化 ent-copalol 形成內(nèi)酯環(huán)，研究人員將 ApCYP71D587、ApCYP71BE50 以及 ent-copalol 合成基因在煙草中進行了共注射，確認在煙草中生成了合成路徑中的關(guān)鍵中間體—新穿心蓮內(nèi)酯苷元（andrograpanin）（圖 2）。

圖 2. 穿心蓮內(nèi)酯合成示意圖

隨后，以新穿心蓮內(nèi)酯苷元作為底物對其余 CYP450s 進行功能驗證發(fā)現(xiàn)，ApCYP706U5 催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 14-deoxyandrographolide；ApCYP72F1 可催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 3-dehydroxy-andrographoide（圖 3）。進一步將 ApCYP706U5 和 ApCYP72F1 與新穿心蓮內(nèi)酯苷元合成基因在煙草葉片共表達后觀察到了穿心蓮內(nèi)酯（andrographoide）的生成（圖 2）。

圖 3. 藥用植物穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯生物合成推測路徑

研究結(jié)論

利用安捷倫的氣質(zhì)和液質(zhì)產(chǎn)品，研究人員在酵母微粒體催化實驗中進一步驗證了上述 P450 的催化功能。同時，利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化進一步驗證了上述四個 P450 對不同底物的催化功能，提出了穿心蓮內(nèi)酯在藥用植物穿心蓮中可能存在生物合成路徑（圖 3）。該研究成果為理解二萜類次生代謝產(chǎn)物的生物合成、穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的異源生物制造和穿心蓮新品種培育奠定了基礎(chǔ)。

專家團隊

中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國重點實驗室孫偉研究員、協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物所賈美榮研究員、成都中醫(yī)藥大學(xué)陳士林院士為該論文的通訊作者。本草基因組學(xué)團隊負責(zé)人陳士林院士 2022 年組織發(fā)布了千種本草基因組研究計劃，在《創(chuàng)新》（The Innovation）、《自然-植物》（Nature Plants）、《分子植物》（Molecular Plant）、《自然-通訊》（Nature Communications）等國際著名刊物發(fā)表了一系列的草藥基因組學(xué)研究成果，極大地推動了學(xué)術(shù)界從分子遺傳學(xué)層面理解中草藥中有效成分的合成、轉(zhuǎn)運、積累和調(diào)控，助力天然產(chǎn)物藥物的綠色生物合成以及高含量藥效成分品種的精準選育。該研究得到了安捷倫科技公司提供全程質(zhì)譜儀器（GC/Q-TOF、LC/Q-TOF）和技術(shù)支持。

參考文獻

[1] Sun W, Wang S, Liang M, et al. Completing the Biosynthesis of the Clinically Important Diterpenoid Andrographolide in Andrographis paniculata[J]. Angewandte Chemie, e202425303.

標簽：安捷倫質(zhì)譜