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細(xì)胞色素P450亞酶1A2活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

本文由 上海科學(xué)儀器有限公司 整理匯編

2018-11-18 10:00 403閱讀次數(shù)

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細(xì)胞色素P450亞酶1A2活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途細(xì)胞色素P450亞酶1A2活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過甲氧基異酚唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)中甲氧基異酚唑轉(zhuǎn)化為羥基異吩唑酮后熒光峰值的變化,即采用熒光法來測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞或組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)或純化微粒體樣品細(xì)胞色素P450亞酶1A2的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。技術(shù)背景細(xì)胞色素P450亞酶1A2,簡(jiǎn)稱為CYP1A2,是肝細(xì)胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一,也是芳香族碳?xì)浠衔锛恿u基酶(arylhydrocarbonhydrorylase;AHH)的成員之一。在人體肝臟里占P450酶系15%。與CYP1A1高度同源,特別是在外顯子2、4、5和6。CYP1A2由多個(gè)多態(tài)性變體,Z常見的是:1A和1F,與kafeiyin代謝和遲發(fā)性皮膚卟啉癥(porphyriacutaneatarda)相關(guān)。CYP1A2的作用在于體內(nèi)外源化合物(xenobiotics),包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝,即單加氧化作用(monooxygenation)和羥化作用(hydroxylation),以及脂類合成包括膽固醇和類固醇。芳香族碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)CYP1A2的表達(dá)。甲氧基異酚唑脫甲基酶(7-methoxyresorufin-O-demethylase;MROD)的活性是細(xì)胞色素P450亞酶1A2的診斷標(biāo)記,其基于MROD選擇性催化細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚唑(7-methoxyresorufin)在甲氧基異酚唑脫甲基酶的催化下,轉(zhuǎn)化為羥基異吩唑酮(resorufin)后熒光峰值的變化(激發(fā)波長(zhǎng)530nm,散發(fā)波長(zhǎng)590nm),來定量測(cè)定細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)為:產(chǎn)品內(nèi)容緩沖液(ReagentA)毫升反應(yīng)液(ReagentB)毫升底物液(ReagentC)微升標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)微升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存在-20℃冰箱里,底物液(ReagentC)和標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)避免光照,有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管:用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作的容器恒溫水槽:用于孵育反應(yīng)比色皿或酶標(biāo)板:用于反應(yīng)和比色的容器熒光分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于熒光分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、測(cè)定準(zhǔn)備1.準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等),置于冰槽里2.設(shè)定好熒光分光光度儀(溫度為37℃):激發(fā)波長(zhǎng)530nm,散發(fā)波長(zhǎng)590nm,并置零3.準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管,標(biāo)記為1至5號(hào)管4.加入xx微升緩沖液(ReagentA)到1號(hào)管5.分別加入xx微升緩沖液(ReagentA)到2至5號(hào)管6.移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)到1號(hào)管,混勻7.小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)到2號(hào)管,混勻8.小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)到3號(hào)管,混勻9.小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)到4號(hào)管,混勻10.將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用,避免光照;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號(hào)緩沖液(ReagentA)標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentD)標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩唑酮濃度1微升微升納摩爾/升2微升微升1號(hào)管納摩爾/升3微升微升2號(hào)管納摩爾/升4微升微升3號(hào)管納摩爾/升5微升00二、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定1.移取xx微升緩沖液(ReagentA)到新的比色皿2.加入xx微升反應(yīng)液(ReagentB)3.加入xx微升底物液(ReagentC)4.加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液5.上下傾倒數(shù)次,混勻6.在37℃溫度下孵育10分鐘7.即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)獲得相對(duì)熒光讀數(shù)8.重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7四次9.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為相對(duì)熒光單位;橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩唑酮濃度(納摩爾/升)三、樣品測(cè)定1.移取xx微升緩沖液(ReagentA)到新的比色皿2.加入xx微升反應(yīng)液(ReagentB)3.加入xx微升底物液(ReagentC)4.加入xx微升待測(cè)樣品(20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈)5.上下傾倒數(shù)次,混勻6.在37℃溫度下孵育10分鐘7.即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè):獲得相關(guān)熒光讀數(shù)8.(選擇步驟)重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7,測(cè)讀新的樣品9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩唑酮濃度四、計(jì)算樣品活性[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩唑酮濃度(納摩爾/升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷10(分鐘)]=皮摩爾/毫升/分鐘÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=皮摩爾/毫克/分鐘五、酶標(biāo)板測(cè)定1.在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品2.分別移取xx微升緩沖液(ReagentA)到相應(yīng)孔中3.分別加入xx微升反應(yīng)液(ReagentB)4.分別加入xx微升底物液(ReagentC)5.分別加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品(20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈)6.輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板7.在37℃溫度下孵育10分鐘8.即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè):獲得相對(duì)熒光讀數(shù)9.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為相對(duì)熒光單位;橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩唑酮濃度(納摩爾/升)10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩唑酮濃度11.活性計(jì)算:[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩唑酮濃度(納摩爾/升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷xx(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=皮摩爾/毫升/分鐘÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=皮摩爾/毫克/分鐘注意事項(xiàng)1.本產(chǎn)品為25次(比色皿)或85次(酶標(biāo)板)操作,包括標(biāo)準(zhǔn)液2.操作時(shí),須戴手套3.系統(tǒng)操作過程中,標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次4.樣品須澄清,至關(guān)重要(本公司提供細(xì)胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒30002.1)5.孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定6.如果酶活性過低,可以增加反應(yīng)時(shí)間至30分鐘7.熒光測(cè)定后,比色皿須清洗徹底8.建議待測(cè)樣本為微粒體,其蛋白濃度為20微克/100微升;待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液,其蛋白濃度為100至200微克/100微升(本公司提供Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1)9.如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度通常人體細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450亞酶1A2活性濃度為:200-600皮摩爾/分鐘/毫克蛋白11.細(xì)胞色素P450亞酶CYP1A2單位活性定義為:在37℃,pH7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1納摩爾甲氧基異酚唑至羥基異吩唑酮所需的酶量作為一個(gè)活性單位12.本公司提供系列毒理學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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