實驗室細胞培養(yǎng)板步驟

　　1、細胞復(fù)蘇

　　將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37℃預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基中(其中胎牛血清約為10%)，輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

　　加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/瓶中，在含5%  CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　2、細胞傳代

　　當(dāng)細胞密度達到80%~90%(過早產(chǎn)量不足，過晚細胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng)，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間，非細胞有絲分裂次數(shù))時，去掉培養(yǎng)基，用1X  PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以蓋住細胞，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度)進行消化，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

　　加入適量DMEM培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。

　　加入DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進行計數(shù)，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3、細胞凍存

　　當(dāng)細胞密度達到80%~90%時，去掉培養(yǎng)基，用1X   PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清，10%DMSO。   一般來講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養(yǎng)，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質(zhì)，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞)，放入凍存管內(nèi)(管內(nèi)有異丙醇，以溫度降低的速度)，立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

　　細胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機械損傷，引起細胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進而促使細胞死亡。

　　4、注意事項

　　(1)預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱;

　　(2)用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手;

　　(3)正確擺放使用的器械：足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染;

　　(4)點燃酒精燈：注意火焰不能太小;

　　(5)嚴格的無菌操作;

　　(6)貼壁細胞消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化;

　　(7)傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作，每種細胞使用一套器材。避免交叉感染;

　　(8)傳代細胞瓶口每次打開或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

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為什么傳代后細胞存活率不佳？

為什么細胞生長不均勻？

為什么細胞生長越來越慢？

……

細胞傳代作為細胞培養(yǎng)中的重要步驟

經(jīng)常有朋友在后臺追問十萬個為什么

今天咱們聊聊細胞傳代教你掌握傳代的技巧

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1.什么是細胞傳代

細胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細胞接觸過密，生長就會受到Y(jié)Z，影響細胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶，使細胞能夠持續(xù)擴增。

細胞傳代可以幫助我們擴大細胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時也避免了因細胞進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

2.一般細胞傳代流程&注意事項

No.1 材料準(zhǔn)備

儀器

①離心機 ②水浴鍋 ③酒精燈 ④超凈工作臺

溶液配制

①PBS液 ② 0.25 ％ 胰蛋白酶 ③基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ④胎牛血清

No.2 傳代前準(zhǔn)備

（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液的瓶子放入37℃溫箱/潔凈水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用酒精棉球擦拭好后放入超凈臺內(nèi)；

（2）75％酒精擦拭超凈工作臺消毒、紫外線照射30min；

（3）在超凈工作臺中按次序擺放好無菌的移液器、移液管、離心管、巴斯德管、培養(yǎng)瓶等；

（4）75%的酒精擦拭雙手消毒；

（5）點燃酒精燈：注意火焰不能太小，注意酒精量不能超過瓶身的2/3。

No.3 實驗步驟

（1）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞；

（2）在超凈工作臺內(nèi)將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒，保證細胞瓶的開口朝向酒精燈方向并保持10cm距離防止明火擾亂氣流雜質(zhì)落入培養(yǎng)體系；

（3）小心吸出舊培養(yǎng)液，加3ml無菌PBS后蓋上瓶蓋，輕輕搖動細胞瓶沖洗細胞，倒棄；

（4）根據(jù)培養(yǎng)瓶的大小加入適量的胰蛋白酶，根據(jù)不同細胞選擇不同消化條件，一般ZJ消化溫度是37 ℃，但是易消化的細胞要注意消化時間避免過度消化；

（5）顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度（注：若細胞疊層生長可先用少量胰酶將疊層細胞消化下來，再對底層生長均勻的細胞進行正常的消化操作，正常細胞避免二次消化）；

（6）加入2倍體積的完全培養(yǎng)基（含血清）中止胰蛋白酶的作用，用巴斯德管/移液管/吸頭等將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液；

（7）將細胞懸液吸入15 ml離心管中；

（8）平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000rpm/min離心5分鐘；

（9）棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2 ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液；

（10）分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

（11）用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱（推薦使用瑞沃德 D180-P二氧化碳培養(yǎng)箱）中繼續(xù)培養(yǎng)。1.5~2小時左右開始沉降并貼附在瓶壁上。

No.4 注意事項

（1）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染；

（2）倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時進行細胞計數(shù)。密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml；

（3）在每一個培養(yǎng)瓶做好標(biāo)記，至少包括細胞名稱、細胞代數(shù)、接種日期、接種人；

（4）部分傳代細胞（如PC12細胞), 少量的胰蛋白酶不影響細胞的生長，故可跳過實驗步驟 (7)-(9);

（5）嚴格的無菌操作；

（6）適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

3. 常見操作問題&解答

Q:貼壁細胞傳代如何使用胰酶？

A：一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時，易造成培養(yǎng)基中細胞碎片增多，黑渣增多，常規(guī)細胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進行消化，細胞密度過高超過80%時，采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進行，DY次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin活性降低，并可減少污染機會。

Q:如何控制胰酶消化時間？

A：胰酶消化的程度是細胞培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵步驟：消化過度，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足細胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性。

不同細胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時間也會有差異。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時間，胰酶的儲存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細胞的密度等有關(guān)。對于新購買的細胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時間，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄ZJ消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

Q:貼壁細胞如何進行傳代？

A：去掉原培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，加3-4ml PBS洗1-2次；棄PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞變圓，細胞間隙明顯，部分細胞剛開始脫離瓶壁，加4ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細胞小心吹打下來，1000 rpm/min室溫離心5min；棄上清，細胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶（視細胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每瓶補足培養(yǎng)基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

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