為什么傳代后細(xì)胞存活率不佳？
為什么細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻？
為什么細(xì)胞生長(zhǎng)越來(lái)越慢？
……
細(xì)胞傳代作為細(xì)胞培養(yǎng)中的重要步驟
經(jīng)常有朋友在后臺(tái)追問(wèn)十萬(wàn)個(gè)為什么
今天咱們聊聊細(xì)胞傳代教你掌握傳代的技巧
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1.什么是細(xì)胞傳代
細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細(xì)胞接觸過(guò)密，生長(zhǎng)就會(huì)受到Y(jié)Z，影響細(xì)胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細(xì)胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶，使細(xì)胞能夠持續(xù)擴(kuò)增。
細(xì)胞傳代可以幫助我們擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時(shí)也避免了因細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。
2.一般細(xì)胞傳代流程&注意事項(xiàng)
No.1 材料準(zhǔn)備
儀器
①離心機(jī) ②水浴鍋 ③酒精燈 ④超凈工作臺(tái)
溶液配制
①PBS液 ② 0.25 ％ 胰蛋白酶 ③基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ④胎牛血清
No.2 傳代前準(zhǔn)備
（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液的瓶子放入37℃溫箱/潔凈水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用酒精棉球擦拭好后放入超凈臺(tái)內(nèi)；
（2）75％酒精擦拭超凈工作臺(tái)消毒、紫外線照射30min；
（3）在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好無(wú)菌的移液器、移液管、離心管、巴斯德管、培養(yǎng)瓶等；
（4）75%的酒精擦拭雙手消毒；
（5）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小，注意酒精量不能超過(guò)瓶身的2/3。
No.3 實(shí)驗(yàn)步驟
（1）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞；
（2）在超凈工作臺(tái)內(nèi)將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒，保證細(xì)胞瓶的開(kāi)口朝向酒精燈方向并保持10cm距離防止明火擾亂氣流雜質(zhì)落入培養(yǎng)體系；
（3）小心吸出舊培養(yǎng)液，加3ml無(wú)菌PBS后蓋上瓶蓋，輕輕搖動(dòng)細(xì)胞瓶沖洗細(xì)胞，倒棄；
（4）根據(jù)培養(yǎng)瓶的大小加入適量的胰蛋白酶，根據(jù)不同細(xì)胞選擇不同消化條件，一般ZJ消化溫度是37 ℃，但是易消化的細(xì)胞要注意消化時(shí)間避免過(guò)度消化；
（5）顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度（注：若細(xì)胞疊層生長(zhǎng)可先用少量胰酶將疊層細(xì)胞消化下來(lái)，再對(duì)底層生長(zhǎng)均勻的細(xì)胞進(jìn)行正常的消化操作，正常細(xì)胞避免二次消化）；
（6）加入2倍體積的完全培養(yǎng)基（含血清）中止胰蛋白酶的作用，用巴斯德管/移液管/吸頭等將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液；
（7）將細(xì)胞懸液吸入15 ml離心管中；
（8）平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000rpm/min離心5分鐘；
（9）棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2 ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；
（10）分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
（11）用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱（推薦使用瑞沃德 D180-P二氧化碳培養(yǎng)箱）中繼續(xù)培養(yǎng)。1.5~2小時(shí)左右開(kāi)始沉降并貼附在瓶壁上。
No.4 注意事項(xiàng)
（1）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染；
（2）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml；
（3）在每一個(gè)培養(yǎng)瓶做好標(biāo)記，至少包括細(xì)胞名稱(chēng)、細(xì)胞代數(shù)、接種日期、接種人；
（4）部分傳代細(xì)胞（如PC12細(xì)胞), 少量的胰蛋白酶不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，故可跳過(guò)實(shí)驗(yàn)步驟 (7)-(9);
（5）嚴(yán)格的無(wú)菌操作；
（6）適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
3. 常見(jiàn)操作問(wèn)題&解答
Q:貼壁細(xì)胞傳代如何使用胰酶？
A：一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過(guò)高時(shí)，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，黑渣增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對(duì)于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度過(guò)高超過(guò)80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，DY次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin活性降低，并可減少污染機(jī)會(huì)。
Q:如何控制胰酶消化時(shí)間？
A：胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過(guò)度，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。
不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度等有關(guān)。對(duì)于新購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄ZJ消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。
Q:貼壁細(xì)胞如何進(jìn)行傳代？
A：去掉原培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，加3-4ml PBS洗1-2次；棄PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯，部分細(xì)胞剛開(kāi)始脫離瓶壁，加4ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細(xì)胞小心吹打下來(lái)，1000 rpm/min室溫離心5min；棄上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶（視細(xì)胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每瓶補(bǔ)足培養(yǎng)基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。
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