為什么傳代后細胞存活率不佳？

為什么細胞生長不均勻？

為什么細胞生長越來越慢？

……

細胞傳代作為細胞培養(yǎng)中的重要步驟

經(jīng)常有朋友在后臺追問十萬個為什么

今天咱們聊聊細胞傳代教你掌握傳代的技巧

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1.什么是細胞傳代

細胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當細胞接觸過密，生長就會受到YZ，影響細胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶，使細胞能夠持續(xù)擴增。

細胞傳代可以幫助我們擴大細胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時也避免了因細胞進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

2.一般細胞傳代流程&注意事項

No.1 材料準備

儀器

①離心機 ②水浴鍋 ③酒精燈 ④超凈工作臺

溶液配制

①PBS液 ② 0.25 ％ 胰蛋白酶 ③基礎培養(yǎng)基 ④胎牛血清

No.2 傳代前準備

（1）預熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液的瓶子放入37℃溫箱/潔凈水浴鍋內(nèi)預熱，用酒精棉球擦拭好后放入超凈臺內(nèi)；

（2）75％酒精擦拭超凈工作臺消毒、紫外線照射30min；

（3）在超凈工作臺中按次序擺放好無菌的移液器、移液管、離心管、巴斯德管、培養(yǎng)瓶等；

（4）75%的酒精擦拭雙手消毒；

（5）點燃酒精燈：注意火焰不能太小，注意酒精量不能超過瓶身的2/3。

No.3 實驗步驟

（1）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞；

（2）在超凈工作臺內(nèi)將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒，保證細胞瓶的開口朝向酒精燈方向并保持10cm距離防止明火擾亂氣流雜質(zhì)落入培養(yǎng)體系；

（3）小心吸出舊培養(yǎng)液，加3ml無菌PBS后蓋上瓶蓋，輕輕搖動細胞瓶沖洗細胞，倒棄；

（4）根據(jù)培養(yǎng)瓶的大小加入適量的胰蛋白酶，根據(jù)不同細胞選擇不同消化條件，一般ZJ消化溫度是37 ℃，但是易消化的細胞要注意消化時間避免過度消化；

（5）顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度（注：若細胞疊層生長可先用少量胰酶將疊層細胞消化下來，再對底層生長均勻的細胞進行正常的消化操作，正常細胞避免二次消化）；

（6）加入2倍體積的完全培養(yǎng)基（含血清）中止胰蛋白酶的作用，用巴斯德管/移液管/吸頭等將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液；

（7）將細胞懸液吸入15 ml離心管中；

（8）平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000rpm/min離心5分鐘；

（9）棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2 ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液；

（10）分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

（11）用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱（推薦使用瑞沃德 D180-P二氧化碳培養(yǎng)箱）中繼續(xù)培養(yǎng)。1.5~2小時左右開始沉降并貼附在瓶壁上。

No.4 注意事項

（1）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染；

（2）倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時進行細胞計數(shù)。密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml；

（3）在每一個培養(yǎng)瓶做好標記，至少包括細胞名稱、細胞代數(shù)、接種日期、接種人；

（4）部分傳代細胞（如PC12細胞), 少量的胰蛋白酶不影響細胞的生長，故可跳過實驗步驟 (7)-(9);

（5）嚴格的無菌操作；

（6）適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

3. 常見操作問題&解答

Q:貼壁細胞傳代如何使用胰酶？

A：一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時，易造成培養(yǎng)基中細胞碎片增多，黑渣增多，常規(guī)細胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進行消化，細胞密度過高超過80%時，采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進行，DY次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin活性降低，并可減少污染機會。

Q:如何控制胰酶消化時間？

A：胰酶消化的程度是細胞培養(yǎng)中的一個關鍵步驟：消化過度，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。

不同細胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時間也會有差異。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時間，胰酶的儲存溫度，是否反復凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細胞的密度等有關。對于新購買的細胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時間，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄ZJ消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

Q:貼壁細胞如何進行傳代？

A：去掉原培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，加3-4ml PBS洗1-2次；棄PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞變圓，細胞間隙明顯，部分細胞剛開始脫離瓶壁，加4ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細胞小心吹打下來，1000 rpm/min室溫離心5min；棄上清，細胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶（視細胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每瓶補足培養(yǎng)基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

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磁力攪拌器和頂置攪拌器作為實驗室最常見的前處理儀器，應用非常廣泛。俗話說，兵器要拿趁手的——攪拌器選型一般從三個方面考慮：攪拌目的、物料粘度、攪拌容器容積大小。好不容易過了挑選一關，拿到手在使用過程中依舊或多或少會遇到不少應用問題。

本期特地為大家?guī)頂嚢杵鞯倪x擇及應用常見問題，滿滿的干貨，務必仔細閱讀啦！

磁力攪拌器

加熱型磁力攪拌器主要用于攪拌或同時加熱攪拌低粘稠度的液體或固液混合物。其基本原理是利用磁場的同性相斥、異性相吸的原理，使用磁場推動放置在容器中帶磁性的攪拌子進行圓周運轉，從而達到攪拌液體的目的。那么問題來了——

Q1 英諾德的磁力攪拌器能連續(xù)運行24小時嗎？

德祥科技：可以，儀器設備沒有規(guī)定最大的運行時間。

Q2 我們是做有機合成實驗的，長時間的反應無人值守，反應結束后需要自動停止加熱，但仍然保持攪拌，可以實現(xiàn)嗎？

德祥科技：可以實現(xiàn)，計時器終點功能；客戶可以自主決定：當反應結束后（計時器達到00:00:00時），加熱和攪拌功能分別是繼續(xù)運行還是停止運行。

Q3 磁力攪拌器設置運行后不攪拌，怎么辦呢？

德祥科技：不攪拌一般是因為電壓不穩(wěn)造成的或者反應液的粘稠度過大，建議在使用過程中注意反應液的粘稠度變化，磁力攪拌器攪不動的情況下也可以選擇頂置攪拌器使用。

Q4 磁力攪拌子怎么消毒呢？

德祥科技：磁力攪拌子有非常多種材質(zhì)可選，涂有聚四氟乙烯（特氟龍）的磁性攪拌子，可以通過多種方式滅菌：例如，可以用高壓滅菌法或酒精或殺菌劑處理。

Q5 英諾德磁力攪拌器運行所需的環(huán)境條件是什么？

德祥科技：相對濕度不應超過80%。環(huán)境溫度應在+5℃到+40℃之間。良好的環(huán)境溫度有助于磁力攪拌器的長壽哦～

頂置式攪拌器

頂置式攪拌器主要應用于混勻、均質(zhì)化、懸浮、注入氣體和高粘度物質(zhì)的循環(huán)。通過錐形尾部的加速，轉移以及延遲產(chǎn)生強烈的流動，這些流動通過不斷旋轉的介質(zhì)產(chǎn)生新的混勻運動，達到均化、混合攪拌的目的。那么來看看以下問題，你都知道答案嘛？

問:固體粉末的混合可以使用頂置攪拌器嗎？

德祥科技：在食品行業(yè)，經(jīng)常需要混合固體粉末，選擇扭矩強大的Tor M 80 A頂置攪拌器套裝，搭配盤旋式攪拌槳，足夠大的扭矩可以均勻攪動，在低速150rpm下可以很好的保證粉末樣本處于循環(huán)流動狀態(tài)，使固體粉末在混合時保持流動狀態(tài)以保證取樣均一。

問:頂置攪拌器攪拌槳的安裝有什么注意事項嗎？

德祥科技：輸出軸和鉆夾頭尤其是攪拌槳的不平衡可導致儀器和整個裝置共振從而導致玻璃器具和攪拌容器的破碎。這有可能對操作者造成傷害，也可能損壞攪拌槳。這種情況下，需要更換攪拌槳以矯正所出現(xiàn)的不平衡。

問:英諾德的頂攪防護等級高嗎？

德祥科技：Tor M 80 A頂置攪拌器外殼材質(zhì)采用鑄鋁涂層，提供良好的密封性，防護等級高達IP 54。

INNOTEG Science One在為制藥、生物學、環(huán)境分析、食品、油漆涂料等行業(yè)用戶高效的完成嚴苛的攪拌任務的同時，還提供了便捷的操作模式、高質(zhì)量產(chǎn)品和高等級安全防護。

英諾德MR5磁力攪拌器

技術參數(shù)：

●  將抗化學腐蝕性能和熱傳導效率完美結合：方形的加熱面盤，搪瓷涂層的鋁合金材質(zhì)；

●   快速升溫；優(yōu)異的加熱功率：850W；

●  轉速范圍：50-1500rpm，盤面溫度范圍：室溫-310℃；

●  可實時顯示粘度變化趨勢，便于觀察實驗進程；

●  實現(xiàn)精確控溫：多種外置溫度傳感器可選，控溫精度最精密可達±0.2℃；

●  可設置間歇運行模式，靈活控制攪拌間歇時間，高效完成結晶等特殊攪拌應用；

●  一體化的定時 / 計時功能，實現(xiàn)無人值守，安全運行！

Tor M 80 A頂置攪拌器

● 轉速范圍：50-500rpm，使用旋鈕即可輕松調(diào)節(jié)設定參數(shù)，操作過程運行平穩(wěn)；

●  儀器小巧輕便，非常易于安裝和移動；

●  最大粘度：60000 mPas；攪拌軸最大轉矩：80 Ncm。

示波器是一種用途十分廣泛的電子測量儀器，可以用它測試不同的電量，如電壓、電流、頻率、相位差、調(diào)幅度等。泰克示波器作為家喻戶曉的品牌之一，大家在使用泰克示波器過程中有注意以下幾點嗎？

一、機殼必須接地

  為了安全，示波器的機殼必須接地。通電前，應檢查電源線有無磨損、斷裂和裸露導線，以免引起觸電事故:檢查電源電壓是否與儀器工作電壓相符。

二、注意使用環(huán)境

避免在直射陽光下或明亮的環(huán)境中使用示波器。在強光下使用示波器時，要用遮光罩，并注意光點不要長時間停留在一點上，以免損傷熒光屏。還應避免在強磁場中使用示波器(例如周圍放置有大功率變壓器會產(chǎn)生強磁場)，因為受外界磁場的影響，測出的波形會有重影和嗓波干擾，甚至使顯示的波形失真。

三、測試前的估算

測試前，應首先估算被測信號的幅度大小，若不明確，可先將示波器的V/DIV選擇開關置于zui大檔，避免因電壓過高而損壞示波器。

四、注意拓展檔位和旋鈕的位置

注意擴展檔位和旋鈕的位置大部分示波器都設有擴展檔位和旋鈕，定量測量時一定要檢查這些旋鈕所處的狀態(tài)，否則會引起讀數(shù)錯誤。

五、直流輸入方式

在使用示波器直流輸入方式時，應先將示波器輸入接地，確定好示波器的零基線，才能方便地測量被測信號的直流電壓。

六、測高壓應注意安全

采用示波器測試高壓電路時，要特:別注意安全。要站在絕緣物上，單手操作，不要觸及設備和其他接地物體，更不要接觸高壓測試點。接探頭時，先切斷高壓測試電路電源，接好后，再進行測試。

七、垂直方式的選擇

當同時觀察兩路波形時，將垂直方式(VERTICARMODE)中的ALT按鈕按下，即兩個通道交替顯示波形。若僅觀察-路波形，將CH1或CH2按下即可，但不要選ALT交替方式，以避免相互間的干擾。

八、幅度的控制

熒光屏顯示波形的幅度，通過調(diào)節(jié)電壓衰減( VOLTS/DIV)的系數(shù)，一定要控制在8格之內(nèi)，如果超出8格，將無法觀察，這對示波器的正常工作不利。

九、示波器可作為高內(nèi)阻電壓表使用

示波器可作為高內(nèi)阻的電壓表使用，因被測電路中有一些高內(nèi)阻電路，若用普通萬用表測電壓，由于萬用表內(nèi)阻低，測量結果會不準確，同時還可能會影響被測電路的正常工作；而示波器的輸入阻抗比萬用表高得多，測量結果不但較為準確，而且還不會影響被測電路的正常工作。

十、注意被測信號的幅度

被測信號電壓不應超過示波器規(guī)定的輸入端zui大輸入電壓(峰值)，以免損壞示波器。

十一、注意日常維護保養(yǎng)

示波器在長期使用中，要保持干燥;和清潔，在使用時應防止振動和沖擊。用完后，關斷電源，拆除引線，以減少偶然事故發(fā)生。不用時，加外罩，防止灰塵侵入，以免造成塵埃積聚而引起高壓飛弧，甚至損壞。

正確操作儀器不僅能事半功倍，還能延長儀器的使用壽命，收好這份安泰測試整理的泰克示波器安全使用指南，干貨滿滿哦。如果大家在使用示波器過程中有任何問題，歡迎訪問安泰測試網(wǎng)。

快到年底，來年的采購即將提上日程

目光不由自主鎖定實驗室常用設備離心機

包括離心機轉子，這一重要的配件

想挑選合適的離心機轉子怎么做功課？

需要考慮哪些方面？

轉子是離心機的重要配件，大多數(shù)離心機主要是由主機和轉子兩部分組成。作為離心機主要的運行部件，轉子的好壞直接影響到分離效果，同時要選擇適合的轉子才能保證離心的安全性。

通常來說，一臺離心機可以搭配多個不同的轉子進行不同的配套使用，并且可以通過不同型號與規(guī)格的轉子來滿足不同實驗的離心需求。選擇離心機轉子主要從以下兩個方面來考慮：離心機轉速不同，決定離心機轉子材料的選擇；不同的實驗需求，也讓離心機轉子選擇有所不同。

一、轉子材質(zhì)如何選擇？? 轉子的材質(zhì)主要綜合考慮以下三個方面：

1. 轉子的受力程度；

2. 轉子材料對所處理樣品的耐腐蝕程度；

3. 轉子在不同類型離心機上所能允許的限定轉速及容量。

? 通常來說，不同轉速所適宜選用的轉子材料不同：

1. 5000r/min以下的低速離心機轉子一般用普通鋼、不銹鋼和工程塑料制造。

2. 5000-50000r/min的高速離心機和部分超速離心機，因其轉速較高，由高速轉動所產(chǎn)生的離心力也越大，而離心力是與材料的密度成正比的。所以50000rpm以下的高速和部分超高速離心機的轉子材料需要選用高強度、高密度的材料，綜合考慮鋁合金材質(zhì)為宜，重量輕、強度高、造價相對較低。

3. 超過每分鐘50000rpm的超高速離心機則最/好選用鈦合金了。鈦合金具有密度小，比強度和比斷裂韌性高，疲勞強度和抗裂紋擴展能力好，低溫韌性良好，抗蝕性能優(yōu)異特性，但是其價格成本也比較高

二、水平轉子和角轉子如何選擇？

離心機的轉子按照實驗需求主要分為兩類，水平轉子和角轉子。選擇哪一類轉子，主要考慮三個關鍵因素：離心類型（微分，速度帶或等密度），轉速和容量范圍。

01

水平轉子

亦稱甩開轉子（擺平或是擺桶轉子）。轉子靜止時，處于轉頭中的離心管中心線與旋轉軸平行。轉頭旋轉加速時，受離心力作用而由垂直位置甩到與旋轉軸成90°角位置，樣品則沉淀集中于離心管底部。

 02角轉子

角轉子是離心中使用最為常見的轉子，顧名思義離心管與轉子的轉軸之間有一定的角度，角度范圍通常在14°-45°之間。主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶液移動的距離很短，碰到外壁的顆粒沿著管壁滑到管底，形成沉淀，因此這種轉子能很快地收集沉淀物。此種轉子重心低，壽命長，轉速較高，能承受的最大離心力較高，最高可達800000×g。角轉子主要用于差異分離、從懸浮液中沉淀出顆?；蚴占w粒等。這些轉子中的空腔的體積范圍從0.2mL到1L，速度范圍從個位數(shù)到1,000,000×g（RCF，相對離心力）。

（▲角轉子）

角轉子中最為常見的是固定角轉子，其重心低，阻力小，運轉穩(wěn)，宜進行高速分離。但是固定角轉子不宜大容量分離，因為顆粒沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后沿管壁滑向管底，管的一側會出現(xiàn)顆粒沉積而產(chǎn)生壁效應，影響分離效果。

 角轉子與微量高速離心機如何搭配

對于微量高速類的離心機來說，常見的角轉子單管容量為1.5mL、2mL、5mL和PCR排管。

瑞沃德微量高速離心機（常溫/冷凍）新增可兼容5mL離心管的氣密性快鎖轉子，不僅可以高溫滅菌，也搭配了快鎖轉子蓋設計，僅需旋轉1/6圈即可快速鎖定，方便樣品拿取。當然我們也可搭配1.5mL/2mL離心管的氣密性快鎖轉子，滿足不同的實驗需求。

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• 最高轉速：15800rpm

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想要開發(fā)有穩(wěn)定生產(chǎn)能力的細胞株，除了在細胞開發(fā)中對于細胞表達能力的評估篩選以外，前期的表達載體的構建過程也非常重要。使用納升移液技術可以顯著提高細胞株過程基因合成，表達載體構建以及轉染篩選等實驗的實驗效率，降低實驗成本。

聲波移液展示Echo?移液系統(tǒng)依靠專 利技術（U.S. Patent 6938995）和創(chuàng)新方法改變移液操作在整個生命科學領域中的應用。它采用動態(tài)液體分析（Dynamic Fluid Analysis?, DFA）技術和聲波移液（Acoustic Droplet Ejection，ADE）技術，讓研究人員能夠移取多種不同類型的液體，完成微量小體積（2.5/25nL）的移液工作。全流程無需槍頭耗材，無交叉風險。

納升移液技術讓細胞株構建

更快、更準、更經(jīng)濟

更快

—— Echo快速任意孔到任意孔移液，極速基因組裝

在質(zhì)粒構建前期，需要非常多的準備實驗，如基因組裝中將不同的DNA片段混合，在檢測反應中將不同的樣本組合，在NGS文庫構建過程中將多個文庫pooling到一起，在CRISPr基因編輯中構建sgRNA文庫等等，這些實驗都需要進行快速、靈活的加樣移液，就算使用高通量的移液工作站，往往也要好幾小時才能完成。納升移液技術Echo的任意孔到任意孔的快速移液特點則讓此類應用簡單、快速化，每次轉移花費更少時間更短。這為基因組裝節(jié)省了高達82%的時間。

從母板任意孔轉移任意體積樣品到目標板任意孔中，實現(xiàn)快速挑選、樣品混合和組合。

有效縮短實驗周期

更準

—— Echo加樣精 準，提高克隆效率

利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，需要對篩選結果進行鑒定， 而qPCR也是常用的鑒定方法之一。使用Echo納升移液技術進行微量化克隆篩選鑒定，可以以更少的實際成本精 準完成實驗。使用Echo完成 qPCR的反應體系構建，通過減少每個組件的體積，并使用不使用tips的Echo，將反應體積縮小10倍，從10 μL減少到1 μL，成本降低了8倍。

精 準減小實驗體積

更經(jīng)濟

—— Echo微量化，縮小反應體系，讓新技術更經(jīng)濟

系統(tǒng)化的設計必然會帶來更大的樣本量，從而導致更高的費用， Echo采用聲波的能量進行無接觸式移液，且每滴液滴僅為2.5nL或25nL，因此可以直接省去吸頭耗材的消耗，也可以將檢測反應體系降低4-100倍，使成本急劇下降。

有效縮減試劑成本

Gibson and Golden Gate Assembly實驗：不同反應體積的成本效益和組裝效率比較

產(chǎn)品信息

“僅用于科研，不用于臨床診斷”