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  小啦啦gg 2017-12-16 16:18:28

  一、基本原理 分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，Z后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。 TNF的提取是將發(fā)酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出來，經(jīng)離心收集混合液中提取的TNF成份的過程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的雜蛋白，由于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度主要取決于蛋白質(zhì)分子表面的水分子數(shù)目，即蛋白質(zhì)表面親水基團(tuán)與水分子形成水化膜的程度和帶電荷的情況，當(dāng)中性鹽如硫酸銨等加入蛋白質(zhì)溶液時，由于中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱或消失，蛋白質(zhì)溶解度降低，同時由于中性鹽的加入，蛋白質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間互相聚集而發(fā)生沉淀。不同的蛋白質(zhì)由于其帶電性，親水性等性質(zhì)的不同，會在不同濃度的鹽中形成沉淀。依此原理可對混合蛋白質(zhì)進(jìn)行粗分離。該實(shí)驗(yàn)中利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白從而使TNF得到初步純化。 二、試劑配制 1、STE（25%蔗糖 10mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1mmol/L EDTA）。 方法：取蔗糖250g，1mol/LTris.HCl10ml，0.5mol/L EDTA2ml，加水至1000ml115℃，20min高壓滅菌。 2、1mol/L MgCl2。 方法：取MgCl2 203.30g，加水至1000ml。 3、Tris-HCl pH8.5。 方法：取Tris 121.14g，用HCL調(diào)pH至8.5，加水至1000ml（12mol/L HCl 約30ml）。 4、0．5mol/L EDTA pH8.5。 方法：取乙二氨四乙酸二鈉186.12g，NaOH20g，加水至1000ml，在121℃下，進(jìn)行20min高壓滅菌。 三、 操作步驟 1、稱取菌體重量，按5~10ml/g菌體加入STE溶液，攪拌至菌體完全懸浮。 2、按0.5~1mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力攪勻后于4℃環(huán)境中放置20min。此時菌液呈粘稠狀。 3、按10mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的脫氧膽酸鈉（DOC）溶液，用力攪勻。 4、加入5~10ml 1mol/L MgCl2溶液，攪勻后加入約40μl Dnase I（25mg/ml）充分?jǐn)嚢柚辆鹤兿　? 5、15000rpm，4℃離心30min。 6、 取離心上清，精確量取其體積，測定蛋白質(zhì)濃度，倒入置于冰浴的燒杯中，邊攪拌邊緩慢加入固體硫酸銨使其達(dá)到50%飽和度。待固體硫酸銨安全溶解后，靜置于0℃環(huán)境中30min。 7、離心，15000rpm，4℃，30min。取離心上清，量其體積，測定蛋白濃度。 8、將離心上清裝入透析袋，4℃攪拌在pH8.5 20mmol/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA溶液中透析。 四、注意事項(xiàng) 1、加入硫酸銨不論是固體硫酸銨，還是加入飽和硫酸銨溶液，加入時應(yīng)邊加入邊攪拌。 2、加入硫酸銨要慢，因?yàn)樘鞎鸬鞍踪|(zhì)發(fā)生共沉淀，加入固體硫酸銨時事先要將硫酸銨研磨成粉末，加入飽和硫酸銨溶液時要一滴一滴地加入。 3、攪拌要慢，攪拌劇烈，蛋白質(zhì)溶液容易起泡沫，由于表面張力效應(yīng)會引起蛋白質(zhì)變性。

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